Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Zebrafischembryo für die Langzeit-In-vivo-Lichtblattmikroskopie zu mounten. Dazu wird zunächst ein Fluor-, Ethylen-Propylen- oder FEP-Rohr gereinigt und mit Methylcellulose beschichtet. Als nächstes wird ein Zebrafischembryo von Interesse beschichtet.

Dann wird der Embryo zunächst in geschmolzene Agarose und dann in das beschichtete FEP-Röhrchen übertragen. Zum Schluss wird der Boden des Eileiters mit einem Arous-Plug verschlossen und die Ausrichtung des eingehängten Embryos sorgfältig überprüft. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die ungestörte Entwicklung von Zebrafischembryonen über mehrere Tage mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung durch in vivo Lichtblattmikroskopie zeigen.

Nun, der Hauptvorteil gegenüber bestehenden Techniken besteht darin, dass wir jetzt Superfischembryonen über mehrere Tage und nicht nur über ein paar Stunden beobachten können. Diese Methode kann mittels Lichtblattmikroskopie wertvolle Einblicke in die langfristige Embryogenese des Zebrafisches liefern. Es kann auch auf andere kleine Organismen wie kleine Meeresorganismen angewendet werden.

Es kann auch mit anderen Mikroskopietechniken wie der optischen Projektionstomographie, der Weitfeldmikroskopie oder der konfokalen Mikroskopie verwendet werden. Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, könnten Schwierigkeiten haben, da das Protokoll einige zeitkritische Schritte beinhaltet und die Beurteilung der endgültigen Position des Embryos etwas Fachwissen erfordert. Um einen FEP-Schlauch vorzubereiten Reinigen Sie ihn zunächst, indem Sie ihn wiederholt mit einem molaren Natriumhydroxid spülen. Übertragen Sie dann das Röhrchen für 10 Minuten in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das mit 0,5 molar Natriumhydroxid und Ultraschall-Acht gefüllt ist.

Übertragen Sie das Polymerrohr in ein kleines Becken mit destilliertem entionisiertem Wasser und spülen Sie es. Anschließend wird es mit 70 % Ethanol gespült, bevor es in ein frisches Zentrifugenröhrchen umgefüllt wird. Mit Ethanol Ultras.

Beschallen Sie das Röhrchen 10 Minuten lang, bevor Sie es in ein kleines Becken mit destilliertem deionisiertem Wasser geben und spülen. Wieder. Schneiden Sie das saubere FEB-Rohr in drei Zentimeter lange Stücke und richten Sie diese bei Bedarf gerade aus. Lagern Sie die gereinigten Röhrchen in einem frischen 50-Milliliter-Röhrchen, das mit destilliertem entionisiertem Wasser gefüllt ist.

Bereiten Sie die Trica-Stammlösung vor. 3%Methylcellulose und sowohl 1,5%als auch 0,1%Aros gemäß dem Textprotokoll. Schmelzen Sie 1,5% Agarro und gießen Sie es in eine Petrischale, um eine Schicht mit einer Dicke von etwa zwei Millimetern zu bilden.

Sammeln Sie Zebrafischembryonen im gewünschten Stadium, die das Fluoreszenzgen Ihrer Wahl positiv exprimiert haben, und übertragen Sie sie in eine frische Schale von E drei unter einem Stereoskop. Beschichten Sie die Embryonen vorsichtig mit zwei scharfen Pinzetten, indem Sie mit einer Pinzette die Corion halten und mit der zweiten Pinzette die Corion aufreißen und abziehen, um eine mehrschichtige Montage durchzuführen. Befestigen Sie mit behandschuhten Händen eine Kanüle mit stumpfem Ende an einer Spritze.

Führen Sie die Kanüle vorsichtig etwa drei Millimeter in ein Ende eines gereinigten Stücks FEP-Schlauch ein. Tauchen Sie anschließend das freie Ende des FEP-Röhrchens in 3%ige Methylcellulose und füllen Sie das Röhrchen mit der Lösung. Drücken Sie dann langsam auf die Spritze, um die Methylcellulose mit dem Medium E drei freizusetzen, wiederholen Sie die Tauch- und Ausstoßschritte.

In der Zwischenzeit erhitzen Sie in einem Wärmeblock ein Aliquot von 0,1 % aros auf 70 Grad Celsius. Wirbeln Sie das Reaktionsrohr kurz ein, bevor Sie es in einen auf 38 Grad Celsius eingestellten Heizblock umfüllen. Lassen Sie das Röhrchen nach dem Erhitzen kurz abkühlen und geben Sie trica bis zu einer Endkonzentration von 133 bis 200 Milligramm pro Liter und Wirbel zu.

Auch hier mit einer Glaspasterpipette. Übertragen Sie einen beschichteten Embryo mit dem vorgewärmten Aros in das Reaktionsröhrchen, wobei so wenig E drei wie möglich übertragen wird. Nehmen Sie mit dem FEP-Röhrchen und der beigefügten Spritze vorsichtig eine kleine Menge Aros auf, bevor Sie den Embryo aufnehmen, und füllen Sie das Röhrchen vollständig mit Arous.

Der Embryo sollte an beiden Enden des Eileiters so positioniert werden, dass der Kopf zur Öffnung zeigt. Um ein Auslaufen des Inhalts zu vermeiden, halten Sie das Rohr in einer horizontalen Position, um das Rohr zu verschließen. Schneide sie mit einer Rasierklinge von der Kanüle ab.

Halten Sie dann das Rohr senkrecht, stecken Sie das Ende langsam durch die gesamte Schicht aus 1,5 % Aros und drehen Sie es leicht. Um ein Austrocknen zu vermeiden, bewahren Sie die eingefasste Probe vor der Bildgebung in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen auf, das mit E drei Medium gefüllt ist. Vergewissern Sie sich, dass der Fisch im FEP-Schlauch gerade positioniert ist und sein Kopf für die Bildgebung direkt auf dem Stopfen sitzt.

Geben Sie Trica in das Medium in der Bildgebungskammer. Hier ist ein transgenes Bild einen Tag nach der Befruchtung. K-G-R-L-G-F-P Zebrafischembryo, der über einen Zeitraum von zwei Tagen aufgenommen wurde, um die Entwicklung des Gefäßsystems zu beobachten.

Der Zebrafisch wird durch das Einbettmedium nicht eingeschränkt und kann sich normal entwickeln. Zum Beispiel hebt sich der Kopf. Der Schwanz streckt sich aus und der Gefäßaustrieb erscheint ungehindert.

Diese Technik kann in 10 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird und das gesamte Material leicht verfügbar ist. Denken Sie daran, alle wichtigen Schritte ohne Verzögerung durchzuführen. Halten Sie alle Lösungen sauber, da Schmutz die endgültige Bildqualität beeinträchtigen kann.