Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Dieses Experiment erzeugt fluoreszenzmarkierte rekombinante Vaccinia-Viren mithilfe einer modularen und schnellen Methode, die auf einer vorübergehenden dominanten Selektion basiert. Zunächst wird ein rekombinanter Vektor erstellt, der einen fluoreszenten Marker enthält, der von synthetisierten minimalen homologen Bereichen sowie Markern für die metabolische und fluoreszente Selektion umgeben ist. Dieser Rekombinationsvektor wird in infizierte Zellen transfiziert und die rekombinanten Viren werden durch metabolische Selektion und Fluoreszenz angereichert. Anschließend wird die metabolische Selektion entfernt, um das Markerkassetten-Gen zu excidieren, und die Zellen, die rekombinante Viren enthalten, werden mittels fluoreszenter Markerauswahl isoliert. Die Analyse viraler Plaques auf Zellmonolagen ermöglicht die Visualisierung einzelner Viruspartikel, die charakteristisch für das fluoreszenzmarkierte Gen sind.

Wir haben diese Methode entwickelt, um rekombinante Viren mit mehreren genetischen Modifikationen zu erzeugen, wobei eine Selektionsmethode verwendet wird, die unabhängig vom Tag wiederholt und universell eingesetzt werden kann. Obwohl das Prinzip der transienten dominanten Selektion bereits früher beschrieben wurde, wollten wir es in größerem Maßstab und modular anwenden, um mehr Flexibilität bei der Vornahme genomischer Modifikationen zu erlangen. Eine visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da das Screening und die Isolierung rekombinanter Virus-Plaques schwierig sein können. Ihre Häufigkeit kann gering sein, weshalb spezielle Methoden für eine effiziente Gewinnung des Virus erforderlich sind.

Markieren Sie also das gewünschte virale Gen am N- oder C-Terminus des Proteins. Identifizieren Sie entsprechend 150 Basenpaare lange flankierende homologe Bereiche. Entwerfen Sie dann eine Oligonukleotidsequenz, die aus den 150 Basenpaare langen linken und rechten Armen besteht, die durch ein Paar ausgewählter Restriktionsstellen getrennt sind. Flanken Sie diesen Bereich außerdem durch ein zweites Paar von Restriktionsstellen, das sich von dem ersten Paar unterscheidet, um die Einbindung in den TDS-Vektor nach der Synthese zu ermöglichen. Überprüfen Sie nun, ob das Oligonukleotid mit den Restriktionsstellen so konzipiert ist, dass es im Leseraster mit der gewünschten Insertionsstelle liegt. Für die Oligonukleotidsynthese stellen Sie sicher, dass die zwischen den linken und rechten Armen eingefügten Restriktionsstellen mit denen übereinstimmen, die den offenen Leserahmen des gewählten Fluoreszenzmarkers flankieren. Fügen Sie diese gleichen Restriktionsstellen mittels PCR auf beiden Seiten des Fluoreszenzmarkers ein. Klonen Sie das synthetisierte Fragment in den TDS-Vektor. Klonen Sie außerdem den Fluoreszenzmarker unter Verwendung der Restriktionsstellen zwischen den Bereichen der linken und rechten homologen Arme in den resultierenden Rekombinationsvektor. Infizieren Sie eine Monoschicht von BS-C-1-Zellen mit Vacciniavirus in serumfreiem Medium.

Eine Stunde nach der Infektion die Zellen mit Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium retten. Transfizieren Sie mit einer Mischung aus Rekombinationsvektor-Plasmid und Transfektionsreagenzien im Verhältnis drei zu eins in serumfreiem Medium. Nach 24 Stunden die Zellen abkratzen und in DMEM ohne fetalen bovinen Serum gewinnen. Den Zellen drei Gefrier-Tau-Zyklen unterziehen, um die Zellen zu lysieren und die Viruspartikel freizusetzen. Um eine ausreichende Trennung einzelner Plaques zu erzielen, infizieren Sie 100 % konfluente Zellmonolagen aus BS-C-1-Zellen mit seriellen Verdünnungen der Virensuspension. Mit flüssigem 10 % FBS und DMEM plus GPT-Selektionsreagenzien überlagern und 24 Stunden inkubieren.

Entfernen Sie die flüssige Überlagerung und verwenden Sie ein fluoreszierendes Mikroskop, um nach Plaques mit diffuser roter Fluoreszenz zu suchen, die der Einbindung von M-Cherry aus dem TDS-Vektor in das Virus entspricht. Abhängig vom Zielgen und dem gewählten Fluoreszenzfarbstoff kann im selben roten Plaque auch eine lokalisierte Fluoreszenz des Markergens beobachtet werden.

Um nun mehrere Plaques für jeden rekombinanten Virus zu gewinnen, diese mit der Pipettenspitze abkratzen und die Zellen mit 100 Mikrolitern DMEM, das 5 % FBS enthält, in ein Eppendorf-Röhrchen überführen. Führen Sie drei Zyklen von Einfrieren und Auftauen der abgekratzten Zellen durch, um die rekombinanten Viren freizusetzen.

Gebe das DMEM, das aufgetauten Virus enthält, auf eine Zellmonolayer in einer 12-Loch-Platte, um die rekombinanten Viren mit GPT-Auswahlreagenzien im Wachstumsmedium zu amplifizieren. Schabe anschließend die erfolgreichen Amplifikationen 24 Stunden nach der Infektion ab. Für einen Plaque-Assay erfolgreich amplifizierter Plaques, die rote Fluoreszenz zeigen, besäe eine 6-Loch-Platte mit einer Monolayer von BS-C-1-Zellen.

Führen Sie eine serielle Verdünnung der rekombinanten Viren durch und infizieren Sie die Vertiefungen mit einer zunehmenden Verdünnung der Viren in FBS-freiem DMEM. Eine Stunde nach der Infektion entfernen Sie das flüssige Medium und überdecken jede Vertiefung mit 0,5 % Agarose in vollständigem minimalem essentiellem Medium. Drei Tage nach der Infektion isolieren Sie die Plaques, die sowohl rote Fluoreszenz als auch die Farbe des gewählten Fluoreszenzmarkers aufweisen.

Verstärken Sie diese erneut ohne GPT-Auswahl. Wählen Sie Plaques aus, die ihre diffuse rote Fluoreszenz verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz entsprechend dem gewählten Tag beibehalten. Fahren Sie mit der Plaque-Reinigung ohne Selektion fort, um eine reine Stammlösung rekombinanter Viren zu erhalten, die die M-cherry- und GPT-Selegensgene verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz entsprechend dem gewählten Tag beibehalten.

Beurteilen Sie die Reinheit der Vorräte mittels einer Plaque-Assay, wobei alle Plaques ein ähnliches Plaque-Phänotyp aufweisen sollen. Amplifizieren Sie die Testvirusvorräte in einer Monoschicht von BS-C-1-Zellen. 24 Stunden nach der Infektion werden die infizierten Zellen in 250 Mikroliter DMEM abgeschabt. Zentrifugieren Sie die infizierten Zellen, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikroliter 0,1 %iger SDS-Lösung in TE-Puffer. Vortexen Sie, um die Zellen zu lysieren. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol hinzu und invertieren Sie zur Vermischung. Zentrifugieren Sie. Gewinnen Sie die obere Phase und wiederholen Sie die Extraktion.

Um anschließend die DNA aus der wässrigen Schicht auszufällen, geben Sie ein Milliliter kalten, 100 %igen Ethanol und 50 Mikroliter Natriumacetat hinzu. Mischen Sie durch mehrmaliges Vorsichtig Invertieren und stellen Sie die Probe über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren zur Pellettierung der DNA entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit, trocknen das DNA-Pellet lufttrocken und lösen es in 50 Mikrolitern TE-Puffer auf. Verwenden Sie diese genomische DNA als Vorlage für die PCR-Detektion viraler Insertionen. Erzeugen Sie rekombinante Viren mit mehreren Markierungen, wie im textuellen Protokoll beschrieben.

Diese rekombinanten Vaccinia-Viren exprimieren mit fluoreszierenden Markern gekennzeichnete Proteine, die gegen virale Strukturproteine, A3 und F13, gerichtet sind, die jeweils Teil des inneren Virus-Kerns und der äußeren Hülle sind. Gene, die entsprechenden in Virionen lokalisierten Proteinen entsprechen, wurden zur Visualisierung von Viruspartikeln ausgewählt. A3 ist ein Kernprotein des Vaccinia-Virions, und F13 ist ein virales Hüllprotein.

Ein doppelt markiertes Virus mit sowohl fluoreszenzmarkiertem A3 als auch F13 ist ebenfalls dargestellt. Mit einem doppelt markierten Virus kann eine Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. In diesem Fall wird das innere Core-Protein des Vaccinia-Virus, A3, rot markiert und das äußere Hüllprotein F13 grün markiert.

Unverpackte Viruspartikel aus der Virusfabrik werden rot dargestellt, verpackte Virionen durch die Kolokalisation der roten und grünen Kanäle. Zur Bestimmung der Rekombinationswirksamkeit zwischen rekombinanten Vektoren und dem Vaccinia-Virusgenom wurde eine quantitative Analyse verwendet. Die Effizienz der homologen Rekombination von Vektoren mit dem Vaccinia-Virusgenom kann bereits mit homologen Regionen von nur 70 Basenpaaren nachgewiesen werden.

Mithilfe dieser Methode wurden Viren mit mehreren fluoreszierenden Markierungen und/oder mehreren Genlöschungen erzeugt. Diese wurden zur Untersuchung des infektiösen Lebenszyklus des Virus, der Rolle viraler Proteine bei der Unterminierung der Wirtsabwehrsysteme sowie der Wechselwirkungen mit den Signalwegen des Wirts eingesetzt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie rekombinante Vaccinia-Viren mithilfe einer Methode erzeugt werden können, die modulare Markierungen verwendet, sorgfältig die gewünschten Rekombinanten identifiziert und in einer Vielzahl von Forschungskontexten anwendbar ist.