Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells
29. Januar 2014
Hier beschreiben wir zwei Assays zur Messung von Komplement-Aktivierung durch Antikörper gegen rote Blutzellen induziert. Der große Vorteil gegenüber den aktuellen Untersuchungen ist die quantitative und einfach zu interpretieren Natur.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Komplementaktivierung durch Antikörper gegen rote Blutkörperchen oder Erythrozyten im Patientenserum zu bewerten. Dies wird durch Inkubation roter Blutkörperchen mit Patientenserum in Gegenwart von blockierenden Anti-C-5-Antikörpern erreicht, um die Ablagerung von C-4 und C3 auf der Erythrozytenoberfläche zu induzieren. Als nächstes werden die Erythrozyten mit fluoreszenzmarkierten Anti-C-4- und Anti-C3-Antikörpern gefärbt, und die Menge der Komplementablagerung auf den Erythrozyten kann dann durch Durchflusszytometrie in einer alternativen Methode analysiert werden.
Die Erythrozyten werden in Abwesenheit von Anti-C-5 mit Patientenserum inkubiert, um eine komplementvermittelte Lyse zu induzieren. Der Prozentsatz der lysierten Erythrozyten kann dann bestimmt werden, indem die Menge an Hämoglobin, die von den Zellen durch Spektrometrie freigesetzt wird, gemessen wird. Der Hauptvorteil dieser neuen Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Hämolyse oder dem Antiglobulintest, die in der Routinediagnostik verwendet werden, besteht darin, dass sie quantitativer Natur ist und wir suboptimale Unterschiede in der Komplementaktivierung feststellen können.
Elizabeth Brook, Postdoktorandin in unserem Labor, wird Verfahren demonstrieren: Beginnen Sie damit, nulltypisierte rote Blutkörperchen dreimal mit PBS zu waschen, dann inkubieren Sie das Pellet 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 0,5%iger Roma-Lane-Lösung, nachdem Sie die Zellen drei weitere Male gewaschen haben, lagern Sie sie als 3%ige Lösung in frischem PBS bei vier Grad Celsius, um die Komplementablagerung auf den Erythrozyten durch Durchflusszytometrie zu analysieren. Inaktivieren Sie zunächst die gewünschte Menge des Patientenserums 30 Minuten lang bei 56 Grad Celsius, während das Serum wärmebehandelt wird. Waschen Sie die mit Brola behandelten roten Blutkörperchen nach der letzten Wäsche dreimal in Roal-Puffer.
Reanimation des Pellets in vbg plus plus mit einer Verdünnung von 0,5 %. Als nächstes an einer Glasperle, 25 Mikroliter mit 0,5 % Erythrozyten, 37,5 Mikroliter frisches AB-Serum und 37,5 Mikroliter mit 200 Mikrogramm pro Milliliter, Anti-C fünf auf jede Vertiefung einer 96 Vertiefung runden Bodenplatte. Geben Sie dann das hitzeinaktivierte Patientenserum in der entsprechenden Konzentration in jede Vertiefung und ergänzen Sie es bei Bedarf mit hitzeinaktiviertem AB-Serum und einschließlich einer Negativkontrolle.
Mit VBG plus plus bringen Sie jede Vertiefung auf ein Endvolumen von 150 Mikrolitern und inkubieren Sie die mit E IA-Folie abgedeckte Platte dann eineinhalb bis zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie nach der Inkubation. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, das mit 0,5 % BSA ergänzt ist, und markieren Sie die Zellen dann mit einem Mikrogramm pro Milliliter. Ein fluoreszenzmarkierter monoklonaler Anti-C3- und Anti-C-Vier-Antikörper inkubiert die Zellen 30 bis 45 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln und resuspendiert dann nach dreimaligem Waschen der Platte die Erythrozyten in 150 Mikrolitern PBS plus 0,5 % BSA pro Stück.
Übertragen Sie die Zellsuspensionen in eine neue runde Bodenplatte mit 96 Vertiefungen, laden Sie die Platte dann auf das Durchflusszytometer, trennen Sie die einzelnen Zellen von den Dubletten mit einem Vorwärtsstreudiagramm. Stellen Sie das Gate auf die einzelnen RBCs ein und wählen Sie dann den entsprechenden Detektionskanal für die Fluoreszenzsignale aus. Quantifizieren Sie die Ergebnisse anhand der medianen Fluoreszenzintensität für die quantitative hämolytische Analyse, erhitzen und aktivieren Sie das Patientenserum und waschen Sie die mit Romain behandelten Erythrozyten, wie gerade gezeigt.
Nach der Inkubation der Erythrozyten mit Komplement- und Patientenserum, wie gerade gezeigt, aber ohne das Anti-C-Fünf, drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 664 GS mit reduzierter Verzögerung herunter. Als nächstes werden vorsichtig 90 Mikroliter Überstand auf eine neue Mikrotiterplatte übertragen, wobei darauf geachtet wird, dass die intakten Zellen nicht übertragen werden und keine Luftblasen entstehen, und dann die Absorption bei vier 14 bis sechs 90 in einem Spektralphotometer express messen. Die Hämolyse als Prozentsatz der Lyse einer Probe von Erythrozyten, die in reinem Wasser inkubiert wurde.
In dieser ersten Abbildung sind repräsentative Streudiagramme für mit Brola behandelte Erythrozyten dargestellt. Hier ist ein geeignetes Gating für einzelne Erythrozyten zu sehen. In der Regel fallen etwa 95 % der Erythrozyten in dieses Einzelzell-Gate. In diesen Histogrammen finden repräsentative Befunde für die Wirkung der autoimmunhämolytischen Anämie oder Aha.
Patientenserum auf C-4- und C3-Ablagerung wird wie erwartet gezeigt, mehr Patientenserum führt zu mehr Komplementablagerung. Kurioserweise erfolgt die Komplementablagerung in zwei unterschiedlichen positiven Peaks. Dies ist wahrscheinlich nicht auf die Heterogenität in der Erythrozytenpopulation zurückzuführen, da die Erythrozyten von einem einzigen Donor entnommen werden, obwohl die Ursache dieses Phänomens noch untersucht wird, die medianen Fluoreszenzintensitäten der Proben in diesen Liniendiagrammen aufgetragen werden, um die Reproduzierbarkeit der C-4- und C3-Abscheidungsassays zu zeigen.
Beachten Sie die große Variation in der Abscheidung der verschiedenen AH H-Patientenproben. Schließlich können in diesen Diagrammen Daten aus einem hämolytischen Assay einer Ahha-Patientenserumprobe mit Autoantikörpern gegen Erythrozyten beobachtet werden. Die Titration mit der Serumprobe ergibt eine klare, reproduzierbare Kurve mit einem geeigneten Komplementinhibitor wie z. B. Anti-C-Fünf.
Das hämolytische Signal kann wegtitriert werden, wie in dieser Grafik gezeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Komplementaktivierung durch spezifische Antikörper gegen rote Blutkörperchen gemessen werden kann, entweder durch durchflusszytometrische Analyse der C3- oder C-Vier-Ablagerung oder durch einen quantitativen hämolytischen Assay.
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Übersicht
In diesem Artikel werden zwei Assays zur Messung der durch Antikörper gegen rote Blutkörperchen (RBCs) induzierten Komplementaktivierung beschrieben. Die Assays sind quantitativ und einfach zu interpretieren, was Vorteile gegenüber bestehenden Methoden bietet.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Hämatologie
- Durchflusszytometrie
Hintergrund
- Die Aktivierung des Komplementsystems ist entscheidend für Immunantworten.
- Antikörper gegen rote Blutkörperchen können zu verschiedenen klinischen Zuständen führen.
- Aktuelle Assays weisen möglicherweise einen Mangel an quantitativer Genauigkeit auf.
- Neue Methoden zielen darauf ab, den Nachweis der Komplementaktivierung zu verbessern.
Zweck der Studie
- Beurteilung der Komplementaktivierung durch Antikörper gegen rote Blutkörperchen.
- Entwicklung eines quantitativen Assays zur besseren Interpretation der Ergebnisse.
- Vergleich neuer Techniken mit etablierten diagnostischen Methoden.
Verwendete Methoden
- Inkubation von Erythrozyten mit Patientenserum und blockierenden Antikörpern.
- Färbung von Erythrozyten mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern.
- Analyse der Komplementablagerung mittels Durchflusszytometrie.
- Bestimmung der Hämoglobinfreisetzung zur Ermittlung der Erythrozytenlyse.
Hauptergebnisse
- Die neuen Assays liefern quantitative Daten zur Komplementaktivierung.
- Suboptimale Unterschiede in der Aktivierung können erfasst werden.
- Die Ergebnisse zeigen eine verbesserte Empfindlichkeit im Vergleich zu traditionellen Methoden.
- Die Durchflusszytometrie-Analyse ermöglicht eine detaillierte Interpretation.
Schlussfolgerungen
- Die neuen Assays vertiefen das Verständnis der Komplementaktivierung.
- Sie bieten eine zuverlässige Alternative zu bestehenden diagnostischen Tests.
- Zukünftige Anwendungen könnten die Diagnose und Behandlung von Patienten verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Bewertung der antikörperinduzierten Komplementaktivierung an roten Blutkörperchen ist entscheidend für die Beurteilung der Wirksamkeit von Komplementinhibitoren und das Verständnis hämolytischer Mechanismen bei autoimmunen und alloimmunen Erkrankungen. Die beschriebenen Durchflusszytometrie- und spektrophotometrischen Assays liefern reproduzierbare, quantitative Ergebnisse, die den Nachweis suboptimaler Unterschiede in der Komplementaktivierung ermöglichen und somit die mechanistische Risikominderung in der Therapieentwicklung unterstützen. Diese Methoden erhöhen die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem sie qualitative Beobachtungen in messbare, übertragbare Biomarker für präklinische und klinische Entscheidungsprozesse umwandeln.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung der durch Autoantikörper oder Alloantikörper auf Erythrozyten induzierten Komplementablagerung (C3/C4).
- Operationaler Wert: Bietet funktionelle Zielstrukturvalidierung durch direkte Messung der Antikörper-vermittelten Effektoraktivität und verringert damit mechanistische Unschärfen bei der Zielstrukturauswahl.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Wirkstoffportfolios, indem quantitative Daten zur Potenz der Komplementaktivierung generiert werden, die über die Weiterentwicklung oder Einstellung komplementmodulierender Therapeutika entscheiden helfen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Eignung: Erzeugt standardisierte, quantitative Ausgaben (mittlere Fluoreszenzintensität, Hämoglobinfreisetzung), die für das Hochdurchsatz-Screening von Komplementinhibitoren oder therapeutischen Antikörpern geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Zeigt geringe Variabilität über verschiedene Serumproben von Patienten hinweg, wodurch eine zuverlässige Bewertung von Substanzen und eine Standardisierung zwischen verschiedenen Laboren ermöglicht wird.
- Plattformnutzen: Nutzt leicht zugängliche Geräte (Durchflusszytometer, Spektrophotometer), um wiederverwendbare Assays zur Messung komplementabhängiger biologischer Aktivität in Entdeckungsprozessen zu erstellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert pathophysiologische Mechanismen bei der autoimmunen hämolytischen Anämie (AIHA) und der alloimmunen Hämolyse und verknüpft die Zielstrukturenbindung mit der funktionellen Aktivierung des Komplementsystems.
- Translationale Kontinuität: Schließt die Lücke zwischen Entdeckung und präklinischer Validierung, indem quantitative Biomarker (Ablagerung von C3/C4, Hämolyse) bereitgestellt werden, die mit dem klinischen hämolytischen Potenzial korrelieren.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht eine mechanistische Risikominimierung durch Quantifizierung der komplementvermittelten Lyse und unterstützt so Sicherheitsbewertungen sowie die Modellierung von Dosis-Wirk-Beziehungen in präklinischen Studien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Assays integrieren sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Sicherheitsbewertung und liefern quantitative Nachweise der Komplementaktivierung, die zur biologischen Risikominderung und Beurteilung des therapeutischen Index beitragen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Quantifizierung antikörperinduzierter Komplementaktivierungspfade und klärt den Wirkmechanismus immunmodulatorischer Kandidaten auf.
- Screening: Liefert gebrauchsfertige, quantitative Ergebnisse (Fluoreszenzintensität, spektrophotometrische Hämolyse), die einen zuverlässigen Vergleich von Testsubstanzen oder Serumproben ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt messbare Endpunkte (mittlere Fluoreszenzintensität, Hämoglobinfreisetzung), die statistische Analysen und den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen in Dosis-Wirkungs-Studien erleichtern.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch krankheitsrelevante Ergebnisparameter, die der Komplementaktivierung bei AIHA und in Transfusionszusammenhängen entsprechen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare, standardisierte Plattform zur Bewertung komplementabhängiger Aktivität bei Antikörpetherapeutika, Biosimilars und Komplementinhibitoren.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem qualitative Komplementtests in quantitative, übertragbare Messungen umgewandelt werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch definierte Protokolle für die Vorbereitung von roten Blutkörperchen, die Inkubation mit Serum sowie die Detektion mittels Durchflusszytometrie oder Spektrometrie.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem komplementaktivierende Risiken früh erkannt werden, wodurch das Risiko von Fehlschlägen in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien bei immunmodulierenden Programmen verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt eine risikoadjustierte Prioritätenfestlegung, indem das Potenzial der Komplementaktivierung quantifiziert wird, was objektive Entscheidungen über die Weiterentwicklung in der Therapieentwicklung ermöglicht.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Immunologie, Durchflusszytometrie und der Handhabung spektrophotometrischer Assays für genaue Messungen der Komplementdeposition und Hämolyse.
- Setzt den Zugang zu Durchflusszytometern mit geeigneten Fluoreszenzkanälen sowie zu Spektrophotometern zur Hämoglobinkonzentrationsbestimmung bei 414/690 nm voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Erythrozytenpräparation (z. B. Nulltyp, mit Bromelain behandelte Erythrozyten) und der Serum-Hitzeinaktivierung, um die Assay-Konsistenz zwischen verschiedenen Anwendern und Standorten sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung auf verschiedene Erythrozytenarten, Antigendichten oder Komplementquellen außer humanem AB-Serum.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die sorgfältige Übertragung des Überstandes, um Zellmitnahme und Luftblasen zu vermeiden, die die Genauigkeit der Hämolysequantifizierung beeinträchtigen könnten.
