Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bindung von kurzen Peptiden an humane MHC-Immunproteine unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Plattenassays mit 3 84 Vertiefungen zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Konkurrenzbindungsassays in der Lösungsphase mit den interessierenden Peptiden durchgeführt werden. Im zweiten Schritt werden die äquilibrierten Peptid-MHC-Zwei-Komplexe mit einem anti-MHC-Zwei-Antikörper eingefangen, der auf hochbindenden ELIZA-Platten immobilisiert ist.

Als nächstes werden die gefangenen Komplexe mit dem mit Streptavidin markierten Opium inkubiert und dann wird das ungebundene Streptavidin weggewaschen und das gefangene Opium aktiviert. Letztendlich kann die zeitaufgelöste Fluorometrie verwendet werden, um die Spiegel des eingefangenen MHC-Zwei-Kontrollpeptids zu quantifizieren. Diese Methode kann erste Einblicke in das immunogene Potenzial von Zielproteinen liefern.

Es ist besonders nützlich für die Validierung der Ausgabe von in silico Prädiktoren. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie 25 Mikroliter frisch verdünnte L 2 43 Antikörperlösung in jede Vertiefung eines 3 84 hinzufügen. Nun, weiße ELIZA-Platte mit hoher Bindung versiegelt die Platte mit einer Polyesterfolie und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Beginnen Sie dann mit einer 10 Millimolar Brühe von jedem Test.

Peptid und DMSO stellen die folgenden Verdünnungsreihen her und Citratphosphatpuffer unter Verwendung von 3 84-Well-Polypropylenplatten. Es ist zu beachten, dass für eine vollständige Polypropylenplatte mit 3 84 Vertiefungen drei separate EIA-Platten erforderlich sind, wie dargestellt. Als nächstes verdünnen Sie die ausgewählten MHC-Stammlösungen auf eine molare Konzentration von 101 Nano in Reaktionspuffer unter Verwendung eines konischen 15-Milliliter-Röhrchens.

Verdünnen Sie dann das Kontrollpeptid von 20 Mikromolaren auf ein Verhältnis von eins zu 100 in dem frisch zubereiteten MHC-Zwei-Mastermix und geben Sie 21,5 Mikroliter des MHC-Zwei-Mastermixes mit Kontrollpeptid zur Positivkontrolle. Geben Sie aus der 3 84-Well-Polypropylenplatte den MHC-Mastermix mit zwei Mastermixen, der das Kontrollpeptid enthält, zu jeder der Testpeptidverdünnungen im Verhältnis eins zu eins, um die Bindungsreaktion auch zu diesem Zeitpunkt zu erzeugen. Zum Schluss verschließen Sie die Bindungsreaktion mit einer Polyesterfolie und inkubieren die Platte 12 bis 24 Stunden lang in einem nicht kohlendioxidkontrollierten Inkubator bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln.

Am nächsten Tag verdünnen Sie die Vertiefungen der Bindungsreaktion in der 3 84. Well-Platte im Verhältnis eins zu eins mit Neutralisationspuffer. Waschen Sie dann die Eliza-Platte dreimal mit 60 Mikrolitern PBS 0,05 % pro Vertiefung zwischen 20 weiteren Übertragungen, 25 Mikrolitern jeder neutralisierten Bindungsreaktionslösung von der 3 84 Vertiefungsplatte in dreifacher Ausfertigung auf den Antikörper beschichtet 3 84.

Nun, Eliza-Platte, inkubieren Sie dann die mit Polyesterfolie bedeckte ELIZA-Platte über Nacht nach der Inkubation bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die ELIZA-Platte dreimal, wie gerade gezeigt, und fügen Sie dann jeweils 25 Mikroliter frisch verdünntes Streptokokken-Din-Opium hinzu. Die mit einer Polyesterfolie bedeckte Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur eine Stunde lang gut inkubieren.

Während der Inkubation bringen Sie 10 Milliliter Verstärkungslösung pro Platte auch im Dunkeln nach einer Stunde auf Raumtemperatur, waschen Sie die ELIZA-Platte wie gezeigt, geben Sie dann 25 Mikroliter Verstärkungslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die mit Polyesterfolie bedeckte Platte 10 bis 15 Minuten lang im Dunkeln. Zum Schluss lesen Sie die Fluoreszenz mit einem zeitaufgelösten Fluoreszenzplatten-Reader mit Opiumeinstellungen ab. In diesem repräsentativen Experiment wurde eine reife Peptidsequenz des Enterobacters Cloe P neun beta-Lactamase auf mutmaßliche Peptidbinder an das MHC-2-Allel untersucht.

DRB eins, fünfzehn oh einhundertsiebzehn Nicht- oder Peptide wurden mit einem obligatorischen P-1-Ankerrest an Position eins identifiziert, der für die MHC-2-Bindung nur bei einem Schwellenwert von 5% erforderlich ist. Peptide mit Werten größer oder gleich 2,6 sind wahrscheinliche Binder. Bei der 5%-Schwelle wird also vorhergesagt, dass nur die Top 11 Peptide MHC zwei DRB 1 15 0 1 binden.

Eine repräsentative Gruppe von vorhergesagten Epitopen wurde für die Analyse in diesem MHC-Zwei-Bindungs-Assay ausgewählt. Beta-Lactamase-Peptidfragmente dieser 15 Reste wurden chemisch synthetisiert, so dass mutmaßliche Nonamer-MHC-2-Epitope in ihre synthetischen Proteinfragmente eingebettet waren. Die Fähigkeit dieser synthetischen Peptide, mit einem biotinylierten Myelin-Basisprotein-B-Kontrollpeptid für die Bindung an MHC zwei DRB 1 15 0 1 zu konkurrieren, wurde dann wie gerade demonstriert analysiert.

Kompetitive Bindungskurven für die synthetischen Peptide sind hier dargestellt. Die IC 50-Werte wurden berechnet, indem die logarithmischen Transformationsdaten unter Verwendung der nichtlinearen Anpassungsfunktion des Prismas für die kompetitive Bindung an einem Ort angepasst wurden. Wie in der Tabelle gezeigt, wie in der Grafik zu sehen ist, teilten sich die Peptide auf natürliche Weise in drei Gruppen auf: starke Bindemittel mit einem IC 50 von weniger als einem Mikromolaren, moderate Bindemittel mit einem IC 50 größer oder gleich einem Mikromolar, aber weniger als 100 Mikromolar und schwache Bindemittel mit einem IC 50 von mehr als oder gleich 100 Mikromol Nach seiner Entwicklung.

Diese Technik ebnete Forschern in den Bereichen molekulare Immunologie und biotherapeutisches Design den Weg, um die wichtigsten molekularen Erkennungsereignisse, die den Anti-Protein-Immunreaktionen bei menschlichen Patienten zugrunde liegen, genauer zu untersuchen.