Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, verschiedene Phasen des Replikationszyklus des Hepatitis-C-Virus zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst genomische HCV-RNA-Transkripte aus linearisierten HCV-Plasmidkonstrukten erzeugt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit H-C-V-R-N-A zu transfectieren. Anschließend werden die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten ausplattiert und verschiedenen Assays unterzogen. Im letzten Schritt wird das Zellkulturüberstand zur Bestimmung der Viruslast gesammelt und die transfizierten Zellen zur Gewinnung von Protein und RNA geerntet. Letztendlich werden Reverse-Transkriptase-PCR, Western-Blotting, Immunfluoreszenz-Assay und die Bestimmung der HCV-Viruslast durchgeführt, um ein robustes infektiöses Zellkultursystem für HCV nachzuweisen.

Der Hauptvorteil dieses infektiösen Hepatitis-C-Virus-Zellkultursystems gegenüber dem HCV-Genomreplikonsystem besteht darin, dass die Schritte Virus-Eintritt, Virionen-Assembly und -Ausschleusung untersucht werden können. Dieses Protokoll kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Hepatitis-C-Virologie zu beantworten, wie beispielsweise die Virion-Morphogenese und die Wirt-Pathogen-Interaktion. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Impfstoffentwicklung hinein, da sie die Charakterisierung abgeschwächter Virusstämme ermöglicht, die als mögliche Impfstoffkandidaten evaluiert werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in das Hepatitis-C-Virus ermöglichen kann, ist sie auch auf andere RNA-Viren der Familie Flaviviridae anwendbar. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, vor die Herausforderung gestellt, hochwertige HCV-Genom-RNA zu erzeugen. Die Untersuchung des vollständigen Replikationszyklus von HCV wurde in Zellkultur nach der Entdeckung eines Genotyp-2A-HCV-Isolats aus japanischem fulminantem Hepatitis-Fall möglich. Die visuelle Demonstration des virologischen Assays ist entscheidend, da der Assay Expertise in molekularen und zellulären Techniken erfordert.

Verwenden Sie ein intragenomisches chimäres Virus vom Genotyp 2A, F-N-X-H-C-V und F-N-X-H-C-V pol-null HCV, zur Beurteilung der viralen Replikation, und linearisieren Sie zuvor generierte virale Plasmide durch Verdauung mit dem XBA-eins-Sperrenzym in einem zwei-Milliliter-Röhrchen. Behandeln Sie anschließend die Plasmide mit Mungobohnen-Nuklease, um stumpfe Enden zu erzeugen.

Reinigen Sie die gespaltenen Plasmide mittels Anionenaustauschchromatographie. Überprüfen Sie die Integrität des linearisierten Plasmids, indem Sie die DNA einer Agarose-Gelelektrophorese unterziehen. Fügen Sie anschließend die linearisierte Plasmid-DNA-Vorlage in ein 0,2-Milliliter-Röhrchen ein, das die Reaktionsbestandteile der T-sieben-RNA-Polymerase enthält, um HCV-genomische RNA-Transkripte zu synthetisieren.

Reinigen Sie die neu synthetisierte, mit DNase behandelte RNA mithilfe eines RNA-Reinigungskits. Überprüfen Sie anschließend die RNA-Produktion durch Agarose-Gelelektrophorese. Danach quantifizieren Sie die RNA mittels Spektrophotometrie.

Lösen Sie die auf Huh-7 basierenden anhaftenden Zellen mithilfe einer Trypsin-Behandlung und sammeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Kegelrohr. Zwei anschließende Zentrifugationsschritte umfassen das Aufschwemmen des Zellpellets mit kaltem Medium mit geringem Serumgehalt. Nach Wiederholung der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in Medium mit geringem Serumgehalt bei einer Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter.

Mischen Sie anschließend insgesamt 10 Mikrogramm transkribierte virale RNA mit 400 Mikrolitern resuspendierten Zellen in einer vorab gekühlten Elektroporationsküvette mit 0,4 Zentimeter Elektrodenabstand. Übertragen Sie die virale RNA mithilfe einer Elektroporation bei 270 Volt, 100 Ohm und 950 Mikrofarad in die Zellen. Danach resuspendieren Sie die elektroporierten Zellen in 10 Milliliter komplettem Wachstumsmedium mit 15 % FBS. Impfen Sie die Zellen nun sowohl in T-25-Flaschen mit etwa 1,2 × 10⁶ Zellen pro Flasche als auch in 48-Well-Platten mit 1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung für Zeitpunkte von 4, 48 und 96 Stunden aus. Ersetzen Sie das Medium vier bis acht Stunden nach der Transfektion durch frisches, supplementiertes Wachstumsmedium mit 10 % FBS, um totes Zellmaterial aus den kultivierten Flaschen und Platten zu entfernen.

Die Kulturüberstände mit einer serologischen Pipette zu den Zeitpunkten 48 und 96 Stunden in einen 15-Milliliter-Konikalrohr gewinnen. Anschließend zelluläre Trümmer durch Zentrifugation bei 15.000 rpm für 10 Minuten bei vier Grad Celsius aus den gesammelten Proben entfernen. Nach der Zentrifugation die zellfreien Überstände bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Lysieren Sie die Zellen zu angegebenen Zeitpunkten zur Protein- und RNA-Analyse mittels Western Blot und reverser Transkriptase-quantitativer PCR oder RT-qPCR. Transkribieren Sie ein Mikrogramm gesamter zellulärer RNA unter Verwendung eines Reverse-Transkriptase-Enzyms und eines spezifischen Primers für den HCV-Sinnstrang, der an die fünfprime nichtübersetzte Region in einem 0,2-Milliliter-Röhrchen bindet. Transkribieren Sie außerdem F-N-X-H-C-V-R-N-A mit bekannter Kopienzahl des Genoms unter Verwendung eines HCV-Sinnstrang-Primers zurück. Führen Sie mittels eines Echtzeit-PCR-Systems die qPCR unter Verwendung von 50 Nanogramm der resultierenden transkribierten cDNA mit spezifischen HCV-Primern und einer qPCR-Supermix-Lösung, die grünen DNA-Bindungsfarbstoff enthält, durch. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen bei der Durchführung der qPCR, um die H-C-V-R-N-A-Kopienzahl zu bestimmen. Trennen Sie nach der qPCR das Zelllysat aus der viralen RNA, die 96 Stunden nach der Transfektion transfiziert wurde, mittels SDS-PAGE auf. Übertragen Sie anschließend die aufgetrennten Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran mittels Trans-Blot-Turbo-Methode. Blocken Sie die Membran mit einer Blockierungslösung, die 5 % Magermilchpulver und 0,2 % Tween-20 in PBS enthält, und legen Sie sie in einen Behälter.

Die Membran mit dem primären mausmonoklonalen Antikörper NS3 in einer Verdünnung von 1:1000 und Beta-Aktin in einer Verdünnung von 1:5.000 bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin-G, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, in einer Verdünnung von 1:5.000 hinzufügen und mittels Chemilumineszenz detektieren.

Zu diesem Zeitpunkt fixieren Sie die H-C-V-R-N-A-transfizierten Zellen mit Methanol für 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius für den Immunfluoreszenz-Assay. Anschließend waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Nach der Blockierung mit dem Blockierpuffer für den Immunfluoreszenz-Assay geben Sie den primären Kaninchen-polyklonalen Anti-NS5A-Antikörper und den primären monoklonalen Maus-Antikörper J2 gegen DSRNA im Verdünnungsverhältnis 1 zu 200 hinzu und inkubieren fünf Stunden bis über Nacht im Kühlschrank bei 4 Grad Celsius. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS nach dem primären Antikörper. Danach geben Sie den sekundären polyklonalen Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin-G-488-Antikörper und den sekundären polyklonalen Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin-594-Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1 zu 1000 hinzu und inkubieren eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Tischschüttler. Nach dreimaligem Waschen der Zellen mit PBS färben Sie die Zellkerne mit dem Farbstoff Hoechst und betrachten sie mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Pflanzen Sie anschließend naiv Huh7.5.1-Zellen mit einer Dichte von etwa drei mal 10 hoch drei Zellen pro Vertiefung in einer 96-Loch-Platte aus. Am nächsten Tag führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung des zellfreien Kulturüberstandes, der von H-C-V-R-N-A-transfizierten Zellen gewonnen wurde, mit Wachstumsmedium durch und impfen Sie diesen verdünnten Überstand in dreifacher Wiederholung auf Huh7.5.1-Zellen auf. Fixieren Sie die Zellen 72 Stunden nach der Infektion mit Methanol für 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Zellen anschließend dem Gefrierschrank und färben Sie sie unter den zuvor beschriebenen Bedingungen für das H-C-V-NS5A-Protein an. Zählen Sie mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops die NS5A-positiven Zellfoki in der Vertiefung mit der höchsten Virusverdünnung und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl an fokusbildenden Einheiten pro Milliliter.

Die Qualität des linearisierten HCV-Plasmids wurde mittels Gelelektrophorese überprüft. Die H-C-V-D-N-A wurde einer T-sieben-RNA-Polymerase-vermittelten In-vitro-Transkription unterzogen, wodurch ein einzelnes RNA-Produkt mit 9,6 Kilobasen entstand. RT-qPCR-Ergebnisse zeigten, dass das Wildtyp-Virus das Genom effizient replizierte. Das Wildtyp-Virus wies im Vergleich zum Pol-Null-Virus eine um eine bis drei log-Stufen höhere Genomreplikation auf.

Das Wildtyp-Virus produzierte das NS3-Protein, das an der Spaltung viraler Proteine und der Genomreplikation beteiligt ist. Das Wildtyp-Virus exprimierte außerdem das NS5A-Protein, und das NS5A-Protein sowie doppelsträngige RNA lokalisierten sich gemeinsam im zellulären Zytoplasma transfizierter Wildtyp-Zellen, was auf eine aktive virale Replikation hindeutet. Titermessungen des Virus zeigten, dass das Wildtyp-Virus infektiös ist und über 10.000 fokusbildende Einheiten pro Milliliter infektiöser Partikel produziert. Sechs Stunden nach der Transfektion wiesen sowohl das Wildtyp- als auch das Pol-null-Virus ähnliche Luciferase-Aktivitäten auf, was darauf hindeutet, dass eine vergleichbare Menge transfizierter RNA translatiert worden war. Allerdings zeigte das Wildtyp-Virus 48 und 96 Stunden nach der Transfektion im Vergleich zum Pol-null-Virus erhöhte Replikationsniveaus des Genoms. Das Wildtyp-Virus produzierte zudem virales NS3-Protein. Das Pol-null-Virus wies eine Grundniveau-Luciferase-Aktivität auf, während das Wildtyp-Virus eine zwei- bis dreifach logarithmisch höhere Replikationsrate im Vergleich zum Pol-null-Reporter-Virus aufwies. Sobald die virologischen Assays für Hepatitis C beherrscht sind, können sie innerhalb von zwei Wochen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, über robuste Zellen und hochwertige HCV-Genom-RNA-Transkripte zu verfügen. Im Anschluss an dieses Verfahren können charakterisierte HCV-Stämme in Tiermodellsystemen getestet werden, um die Fitness in vivo sowie Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen.

Die Entwicklung eines infektiösen HCV-Zellkultursystems ebnete den Weg dafür, dass Forscher die Schritte der Virion-Morphogenese und des viralen Austritts im HCV-Replikationszyklus untersuchen konnten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie verschiedene virologische Assays durchgeführt werden, um unterschiedliche Phasen des Replikationszyklus des Hepatitis-C-Virus zu charakterisieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Hepatitis-C-Virus äußerst gefährlich sein kann, und denken Sie stets daran, Sicherheitsvorkehrungen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung zu treffen, während Sie dieses Verfahren durchführen.