BEST: Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine große Anzahl rekombinanter Nachkommen aus einer Hefekreuzung auf eine Weise zu erzeugen, die die Information darüber beibehält, welche Nachkommen von derselben ursprünglichen Vierheit abstammen. Dies wird erreicht, indem zunächst der heterozygote diploide Stamm, der in der Kreuzung verwendet werden soll, mit einer Plasmidbibliothek transformiert wird, die einen Tetra-spezifischen Barcode und einen sporulationsspezifischen Fluoreszenzreporter enthält. Der zweite Schritt besteht darin, die barcodierten Zellen auf das Sporulationsmedium zu übertragen.

Dies ermöglicht die Bildung von Salmlern und induziert die Expression des GFP-Fluoreszenzreporters in Salmlern, aber nicht in Zellen, die nicht sporulieren. Anschließend trennt ein Faxsortierer die fluoreszenzmarkierten Salmler von anderen Zellen ab und legt sie direkt in eine Agarplatte, wo die äußere Beschichtung der Salmler enzymatisch verdaut wird. Der letzte Schritt besteht darin, die Sporen der verdauten Salmler mit Glasperlen zu trennen und über die Oberfläche der Agarplatte zu verteilen, so dass jede Spore eine einzige Kolonie bilden kann.

Letztendlich werden die mit dieser Methode erhaltenen Stämme unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Multiplex-DNA-Sequenzierungsprotokolls genotypisiert, das den Tetra-spezifischen Barcode jedes Stammes liest. Die Barcodes werden dann verwendet, um jeden der vier Stämme zu identifizieren, die aus einem einzigen miotischen Ereignis hervorgegangen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der manuellen Ted-Trockendissektion mit einem Mikromanipulator besteht darin, dass ein Forscher in nur wenigen Stunden mehrere tausend rekombinante Nachkommen isolieren kann.

Die diploiden Hefezellen, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden zuvor mit einer Bibliothek von barcodierten Plasmiden, wie im begleitenden Manuskript beschrieben, transformiert und bei minus 80 Grad Celsius gelagert, um Zellen aus den gefrorenen Stängeln wiederzubeleben. Züchten Sie sie über Nacht in fünf Millilitern YPD plus 200 Mikrogramm pro Milliliter G vier 18 bei 30 Grad Celsius unter Rühren am nächsten Tag. Waschen Sie die Zellen aus den Übernachtkulturen dreimal in PBS und resuspendieren Sie die Zellen dann auf ein Endvolumen von zwei Millilitern in Sporulationsmedium plus 200 Mikrogramm pro Milliliter.

G four 18 Rühren Sie Sporulationskulturen bei Raumtemperatur. Überwachen Sie den Fortschritt der Sporulation täglich, bis sich keine neuen Teden mehr bilden. In der Regel dauert dies zwischen zwei und vier Tagen, wenn die Kulturen gut ausgebildete Vierheiten und relativ wenige Dyaden enthalten.

Die Kulturen aus dem Rühren nehmen und mindestens sieben Tage bei Raumtemperatur ruhen lassen, bevor die Tetrade sortiert wird. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist eine gute Trennung der Sporen. Wir haben empirisch festgestellt, dass es die Sporentrennung erheblich verbessert, wenn man die Sporenkulturen mindestens eine Woche lang ohne Bewegung bei Raumtemperatur ruhen lässt, bevor

Die Tetraden aus der Sporulationskultur können durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder Fax nachgewiesen und isoliert werden, da die barcodierten Plasmide in den diploiden Zellen auch ein sporulationsspezifisches GFP-Fusionsprotein tragen. Das hier beschriebene Protokoll wurde für eine Faxarie an zwei entwickelt. Um diesen Vorgang zu starten, laden Sie die sporulierte Kultur in den Faxsorter und richten Sie zwei Vorwärtsstreu- und Seitenstreuschleusen ein, um Ablagerungen, verklumpte Zellen und mehrere Zellen pro Tröpfchen auszuschließen.

Es sollte eine Population von fluoreszierenden Zellen geben, die bei Verwendung des PS 2-GFP-Reporterkonstrukts Dyaden und Tetradengang umfasst, wobei GFP versus FSC diese Fluoreszenzereignisse einschließt. Abhängig vom Hintergrund des Stammes kann es notwendig sein, einen zusätzlichen Gang einzubauen, um Klumpen zu entfernen, die Salmler und andere Zellen enthalten. Überprüfen Sie ein FSC-Histogramm der Fluoreszenzereignisse

In diesem Beispiel sind Ereignisse im linken Peak hauptsächlich Salmler, und Ereignisse im rechten Peak sind im Allgemeinen Salmler mit einer angehängten Knospe. Wenden Sie ein abschließendes Tor an, das Ereignisse mit niedrigerem FSC enthält, die hauptsächlich Salmler sind, die durch die roten Balken angezeigt werden. Überprüfen Sie die Effizienz des Anschnittregimes, indem Sie ca. 1.500 Salmler auf einen Objektträger sortieren und das Verhältnis von Tetraden zu Nicht-Tetraden zählen. Unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops mit 400-facher Vergrößerung kann der Prozentsatz der Tetraden genau geschätzt werden, indem nur etwa 200 sortierte Ereignisse gezählt werden, aber die Sortierung von etwa 1.500 reduziert die Zeit, die für die Suche nach Zellen auf dem Objektträger aufgewendet wird.

Diese Hellfeldbilder fügen eine 600-fache Vergrößerung hinzu. Zeigen Sie Beispiele für Tetraden auf der linken Seite und Nicht-Tetraden auf der rechten Seite nach der Faktensortierung. Überprüfen Sie regelmäßig, ob der Sortierer die Anzahl der Ereignisse korrekt meldet, indem Sie 25 Salmler auf einen Objektträger sortieren und die im Tröpfchen enthaltenen Zellen mit einem Phasenkontrastmikroskop bei 400-facher Vergrößerung untersuchen.

Es sollten 25 Tetraden in dem Tröpfchen sein. Wiederholen Sie diesen Vorgang drei- oder viermal, um die Varianz des Faxgeräts in diesem Lauf zu beurteilen. Bereiten Sie die Agarplatten für dieses Verfahren vor, indem Sie die gewünschte Anzahl von YPD plus G vier 18-Platten mindestens 1,5 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator erwärmen, der in der Nähe des Faxsortierers aufgestellt ist.

Ein Hauptmerkmal des Sortierprotokolls ist die Fähigkeit, nach Faxen sortierte Tetraden genau auf eine bestimmte Stelle auf einer Agarplatte zu richten, die einen Pool von X-Lösung enthält. Platzieren Sie dazu zunächst eine Landmark-96-Well-Platte auf der automatischen Zellabscheidungseinheit des Sorters. Bereiten Sie als Nächstes ein Sortierlayout vor, das 25 Salmler in eine Vertiefung von 96 sortiert.

Die Gutformatsortierung von 25 Salmlern pro Platte ergibt gut getrennte Kolonien. Wähle eine Vertiefung in der Nähe der Mitte des Tellers. Zum Beispiel, nun ja, D fünf.

Bringen Sie einen Stapel mit 10 Agarplatten aus dem 37 Grad Celsius heißen Inkubator zum Sortierer. Nehmen Sie eine Agarplatte und pipettieren Sie 25 Mikroliter zy-Lösung auf den Agar in der Nähe der Mitte der Platte. Platzieren Sie dann die Platte auf der Landmark 96-Well-Platte, und richten Sie das X-Tröpfchen über dem Ziel aus.

Nun, das wurde früher gewählt. Nun, D fünf. Beginnen Sie mit der Sortierung und geben Sie 25 Salmler in die Mitte des zy Tröpfchens auf die Agarplatte.

Nehmen Sie die Platte heraus und decken Sie sie ab. Wiederholen Sie die Sortierung für jede Platte, bis auf jeder Platte im Stapel 25 Tetraden in Zamo-Tröpfchen sortiert wurden. Den Stapel mit den Salmlerplatten wieder in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator geben.

Bringen Sie den nächsten Stapel von 10 Platten zum Sortierer und wiederholen Sie den Sortiervorgang. Die Sporen können abgetrennt werden, nachdem die tetradenhaltigen Agarplatten 1,5 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wurden. Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie 15 bis 25 sterile drei Millimeter große Glasperlen auf jede Platte und schütteln Sie die Platten als zwei Stapel von fünf Platten drei bis fünf Minuten lang.

Die beste Sporenabscheidung wird erreicht, indem die Platten starr von Seite zu Seite oder von vorne nach hinten bewegt werden. Bewegen Sie die Platten nicht so, dass die Perlen um die Außenkante der Platte wirbeln. Lassen Sie die Perlen auf den Tellern, wenn Sie fertig sind.

Legen Sie den Stapel der Platten mit den Perlen nach oben in einen 30 Grad Celsius heißen Inkubator. Nehmen Sie den nächsten Stapel Platten aus dem 37 Grad Celsius heißen Inkubator und wiederholen Sie den Vorgang zur Sporentrennung mit den Kügelchen. Inkubieren Sie alle Platten über Nacht bei 30 Grad Celsius am Tag nach der Trennung der Sporen.

Nehmen Sie die Platten vorsichtig aus dem 30 Grad Celsius heißen Inkubator, ohne die Glasperlen zu stören. Auf den Platten sollten sich kleine Kolonien gebildet haben. Entfernen Sie die Glasperlen, indem Sie die Platten vorsichtig und schnell über einem tiefen Behälter umdrehen.

Wenn Sie auf die Unterseite der Platte klopfen, während sie umgedreht ist, können Sie Perlen entfernen, die an der Platte haften. Die Behälter sollten tief genug sein, um die Kügelchen aufzufangen, ohne dass sie hochspringen und auf die Agarplatte treffen. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte und verwenden Sie die Anzahl der Kolonien, um die Effizienz der Sporentrennung und -rückgewinnung abzuschätzen.

Zum Beispiel könnten 25 Tetraden pro Platte für eine Kreuzung mit einer Lebensfähigkeit von nahezu 100 % insgesamt 100 Kolonien pro Platte ergeben, von Platten mit einer ausreichenden Anzahl von Kolonien, z. B. mehr als 65 für eine hohe Lebensfähigkeit. Kreuztransfer von Zellen aus jeder Kolonie in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte, die YPD-Flüssigkeit plus G vier 18 enthält. Notieren Sie sich auch, welche Vertiefungen Kolonien aus derselben Agarplatte enthalten.

Diese Informationen werden später zur Unterstützung der Tetra-Zuordnung verwendet. Die beste Software kann die Geschwindigkeit, mit der Sporen von Tetraden isoliert werden können, erheblich verbessern. Obwohl die aktuelle Iteration der Methode im Vergleich zur manuellen Dissektion einen gewissen Effizienzverlust aufweist, wurde die Binomialverteilung verwendet, um den erwarteten Anteil der Tetraden mit mindestens einer erfolgreich gewonnenen Spore zu berechnen, die 1, 2, 3 oder vier Kolonien produziert, basierend auf dem Anteil aller erfolgreich gewonnenen Sporen.

Diese Grafik kann als grober Anhaltspunkt für die Anzahl der Stämme dienen, die sich schließlich zu drei oder vier Sporensalmlern zusammensetzen, wie hier beobachtet. Die Anzahl der gefundenen vollständigen Salmler nimmt mit zunehmender Anzahl der Kolonien pro Platte in dieser Studie zu. 25 Rad von quer mit einer Sporenviabilität von nahezu 100 %, wie durch manuelle Dissektion bestimmt, wurden auf 149 Agarplatten plattiert.

Die maximale Anzahl der beobachteten Kolonien pro Platte betrug 80, was darauf hindeutet, dass 20 Sporen keine eigenständigen Kolonien bildeten. Die durchschnittliche Anzahl der Völker pro Platte betrug 62 4, 354 Völker von 61 Platten mit 65 oder mehr Völkern wurden geerntet und sequenziert. Von den 3.700 Stämmen, die die Sequenzierungsqualitätskontrolle bestanden haben, konnten 2.665 oder 72 % rechnerisch in drei oder vier Sporentetraden eingeteilt werden, sobald sie beherrscht waren.

Mit dieser Technik können mehr als tausend Tetraden pro Stunde verarbeitet werden. Für Genauigkeiten von mehr als drei Stunden benötigen Sie jedoch Unterstützung.