Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Erzeugung von Phospholipid-Doppelschicht-Vesikeln mit erhöhter Kontrolle über Membran, Unla, Molarität, Monodispersität und internen Inhalt. Mit Hilfe von CAD wird eine Kammer aus Acrylplatten und Naturkautschuk hergestellt. Eine suspendierte Lipiddoppelschicht wird hergestellt, indem die Kammer mit Lipiden und Lösung beladen wird.

Als nächstes wird ein Tintenstrahldrucker, der die zu verkapselnde Lösung enthält, mit der Strahlvorrichtung aufgebaut. Sobald die entsprechenden Einstellungen vorgenommen wurden, erzeugen gestrahlte Flüssigkeitsimpulse Lipid-Doppelschichtvesikel. Letztendlich führt das mikrofluidische Jetting zu wiederholbaren monodispergierten Doppelschichtvesikeln.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Elektrobildung, Emulsions- oder Tröpfchenerzeugung ist ein erhöhtes Maß an Kontrolle über die Membran, die einseitige Molarität, die Monodispersität und den internen Inhalt. Johanna Harrow, eine Doktorandin aus einem Labor, wird das Verfahren demonstrieren und von Kara Patel, einer Studentin, assistieren. Mit CAD-Software zeichnen Sie eine Form für die Kammer, die mit einem Laserschneider hergestellt werden kann. Das wird bis ins Unendliche gut geformt abfließen.

Schneiden Sie dann mit einer Schere ein kleines Rechteck aus einer 0,2 Millimeter großen Acrylplatte aus, das als Boden der unendlichen Form dient. Befestigen Sie diesen gut mit schnell trocknendem Klebstoff und achten Sie darauf, dass kein Klebstoff in die Sichtbereiche gelangt. Die Acrylplatte sollte bündig mit der Kammerwand abschließen und am Boden der Kammer befestigt werden.

Drittens: Mit schnell trocknendem Kleber ein dünnes Stück Naturkautschukplatte über die gebohrten Löcher kleben. Drücken Sie sie mit einer Pinzette fest. Testen Sie alle geklebten Nähte auf Undichtigkeiten.

Es sollte keine geben. Zum Schluss stechen Sie mit einer 23-Gauge-Nadel Löcher durch die Bohrlöcher in den Gummi, durch diese Löcher wird die piezoelektrische Tintenstrahlspitze eingeführt. Stammphospholipide sollten in Chloroform gelöst und bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

D-P-H-P-C oder DOPC. In dieser Demonstration werden Lipide verwendet. In Chloroform gelöste Lipide werden in ein Glasfläschchen überführt, während das Fläschchen schräg gehalten wird, und die Lipide vorsichtig unter Argon- oder Stickstoffgas getrocknet werden.

Stellen Sie dann die Durchstechflasche mit leicht lockerer Kappe ein bis zwei Stunden lang unter Vakuum, um Lösungsmittelreste zu entfernen. Für diesen Schritt kann auch ein Trockenmittel verwendet werden. Solubilisieren Sie nun die Lipide im Endbelag auf eine endgültige Lipidkonzentration von 25 Milligramm pro Milliliter.

Vortex die Lösung. Die Kappe kurz mit Param verschließen und anschließend 15 Minuten beschallen. Lagern Sie diese Lösung bei minus 20 Grad Celsius.

Bereiten Sie als Nächstes eine Saccharoselösung mit physiologischer Osmolarität vor. Das ist die Jetting-Lösung. Erwäge, der Lösung einen Tropfen dunkle Lebensmittelfarbe oder fluoreszierende Kügelchen hinzuzufügen, um den Kontrast oder die Fluoreszenz zu erhöhen.

Laden Sie die Saccharoselösung in eine Ein-Milliliter-Spritze, um eingeschlossene Luft zu entfernen. Schnippen Sie mit der Spritze, so dass alle Blasen zur Köderöffnung aufsteigen und ausgestoßen werden können. Befestigen Sie anschließend einen 33-Millimeter-Filter mit 0,22 Mikron an der Spritze und drücken Sie ein Tröpfchen durch den Filter.

Schrauben Sie nun den weiblichen Köderadapter des Inkjets ab und drücken Sie ihn auf das Ende des Filters. Drücken Sie etwas Flüssigkeit heraus, um eingeschlossene Luft zu entfernen. Befestigen Sie abschließend die Spritze an der Oberseite der Tintenstrahlflüssigkeit.

Sollte zur Tintenstrahlspitze wandern, wenn die Spritze richtig angebracht wurde. Montieren Sie zunächst die Spritzenbaugruppe am Mikroskoptisch und verdrahten Sie den Tintenstrahlregler für dieses Experiment. Der Tisch und die Spritze müssen unabhängig voneinander gesteuert werden, wobei sich sowohl der Tisch als auch die Spritze zur Visualisierung in drei Dimensionen bewegen.

Richten Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera ein, die mindestens 1000 Bilder pro Sekunde aufnehmen kann. Stellen Sie die Option so ein, dass die bildbasierte automatische Triggerung zum Initiieren von Aufnahmen verwendet wird. Befestigen Sie nun die Kammer mit Klebeband an der Bühne und richten Sie die Tintenstrahlspitze vorsichtig an dem Loch in der Gummiplatte an der Seite der Kammer aus.

Zuerst mit dem Auge justieren und dann mit dem Mikroskop fein justieren. Sobald sie ausgerichtet ist, ziehen Sie die Spritze entlang einer Dimension zurück, um die unendliche Form zu laden. Nun, dann üben Sie leichten Druck auf den Kolben aus, so dass sich ein Tröpfchen auf der Düse bildet.

Dies sorgt für einen anfänglichen Gegendruck. Die Jetting-Parameter müssen eingestellt werden. Die nächsten spezifischen Werte für eine trapezförmige bipolare Welle werden auf dem Bildschirm dargestellt: die angelegte Spannung und die Anzahl der Jet-Pulse pro Trigger-Kontrollvesikelgröße.

Beladen Sie nun die Kammer mit 25 bis 30 Mikrolitern der Lipidlösung am Ende der Dekade, wobei die gesamte Oberfläche der unendlichen Form bedeckt ist. Nun, dann zu jedem, gut 25 Mikroliter Glukoselösung an den äußersten Rand geben, indem Sie langsam und gleichmäßig pipettieren, die Glukose sollte sich nicht in die Lipidlösung mischen. Innerhalb von 10 Minuten bildet sich eine Lipiddoppelschicht in der Mitte der Kammer.

Das Einrichten der Doppelschicht ist der kritischste Schritt, da die Doppelschicht instabil ist und je nach Vorbereitung brechen kann. Sich gedulden. Es wird funktionieren, wenn du übst, die Kammer ein paar Mal zu füllen.

Führen Sie nun die Tintenstrahlspitze vorsichtig wieder in die Kammer ein, wenn sich die Spitze innerhalb von 200 Mikrometern von der Tröpfchenschnittstelle befindet. Bilayer, starten Sie den Jetting-Prozess und zeichnen Sie die Daten mit dem Tintenstrahl auf, der einen Einblick in den Prozess der Vesikelerzeugung bietet. Zum Beispiel beeinflusste die Variation des Abstands zwischen der Tintenstrahldüse und der Lipiddoppelschicht die Kraft, die die Membran verformt. Schließen.

Die Nähe zur Doppelschicht fokussierte den Jetstream und verhinderte, dass die Membran Energie vom Punkt der Vesikelerzeugung weg ableitete. Außerdem nahm die Wirbelbewegung mit der Spannung zu, die an den elektrischen Pizo-Aktuator angelegt wurde. Die Vesikelbildung wurde als eine Abfolge von Ereignissen nach ihrer Entstehung visualisiert.

Die Vesikelstabilität variierte tendenziell mit dem Vesikeldurchmesser, wobei kleinere Vesikel stabiler waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Lipid-Violator-Vesikel mit Hilfe von mikrofluidischem Jetting erzeugt.