Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie

Ziel des folgenden Versuchs ist es, eine Nachbildung einer Kohlenstoff-Platin-Probe von biologischen oder anderen Materialien für die Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie zu erzeugen. Um dies zu erreichen, werden Proben, die als Doppel- und Einzelrepliken präpariert werden, ultraschnellen Gefrierraten unterzogen, um die Bildung von Eiskristallen zu begrenzen. Dann wird die gefrorene Probe durch ferngesteuerte Manipulation bei flüssigem Stickstoff, den sogenannten Temperaturen, im Hochvakuum gebrochen, wodurch die Membran durch die Lipiddoppelschicht gespalten wird, wodurch eine extrazelluläre Fläche und eine Fläche entsteht, die proximal zum zytoplasmatischen Aspekt liegt.

Als optionaler Zusatzschritt. Die zugrunde liegenden Merkmale können sichtbar gemacht werden, wenn Wasser von der Oberfläche der gebrochenen Probe geätzt wird, indem der kühlende Mikrotomarm über dem Probentisch positioniert wird, um einen Temperaturunterschied zu erzeugen, der dazu führt, dass Wasser von der Oberfläche abhebt. Als nächstes wird eine Nachbildung durch Verdampfen von Kohlenstoff und Platin über die gebrochene Oberfläche erzeugt.

Die Originalprobe wird aus der Replik verdaut und auf ein Transmissionselektronenmikroskopie-Probengitter entnommen. Letztendlich wird das Gefrierfraktur-Gefrierätzen verwendet, um dreidimensionale strukturelle Details von Zellmembranen, molekularen Arrays und Nanomaterialien bei der Untersuchung durch Transmissionselektronenmikroskopie darzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Untersuchung ultradünner Schnitte besteht darin, dass die interessierenden Objekte in drei Dimensionen mit elektronenmikroskopischer Auflösung betrachtet werden können.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zell- und Molekularbiologie sowie der Nanotechnologie zu beantworten, wie z. B. die dimensionalen und strukturellen Eigenschaften von Zellmembranen und die Organisation von molekularen und Nanomaterial-Arrays. Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich feststellte, dass ähnliche Studien an eukaryotischen Protesten mit wichtigen Entdeckungen durchgeführt worden waren, aber dass relevante Themen der menschlichen Gesundheit nur begrenzt beachtet wurden. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung der biologischen Proben für die Gefrierbruch-Gefrierkante, wie im Textprotokoll beschrieben.

Wählen Sie Gold- oder Kupfer-Probenstummel in geeigneter Größe und Form für die zu bearbeitende Probe mit einer feinen Pinzette und/oder kleinen Spritzennadeln aus. Positionieren Sie kleine Fragmente der Probe auf der Oberseite eines Probenstummels aus Metall. Reduzieren Sie den Flüssigkeitsgehalt der Probe auf eine klebrige, leicht klebstoffartige Konsistenz, indem Sie mit Filterpapier für Einzelrepliken Flüssigkeit vom Rand des Stummels abziehen.

Verwenden Sie kleine Spritzennadeln, um einen Gewebehügel auf dem Stummel für Doppelrepliken zu erzeugen. Kehren Sie einen weiteren Stummel um, positionieren Sie ihn genau über dem Stummel und legen Sie ihn leicht auf die Probenoberfläche. Ein Sandwich erstellen.

Drücken Sie die Probe nicht zwischen den beiden Stummeln heraus. Füllen Sie anschließend zwei isolierte Duo-Gefäße mit flüssigem Stickstoff. Das erste Gefäß beherbergt einen Metallpfosten mit einer kleinen Bohrung, die zur Verflüssigung einer kleinen Menge Propangas aus einer handelsüblichen Flasche verwendet wird.

Das zweite Gefäß ist ein Trennwand-Aufbewahrungsgefäß für die kurzzeitige Aufbewahrung von gefrorenen Proben unter flüssigem Stickstoff. Verwenden Sie Propan nur in einer für diese Verwendung zertifizierten Chemikalienhaube. Achten Sie darauf, fremde Zündquellen zu vermeiden, Kleidung zu verwenden, die vor niedrigeren Temperaturen schützt, und für eine ausreichende Belüftung zu sorgen, da Propan explosiv ist.

Kann bei Kontakt Gefrierverletzungen verursachen und ist ein Erstickungsmittel. Öffnen Sie mit der Zylinderdüse im Propan das Zylinderventil und lassen Sie das Gas in die Vertiefung des ersten Behälters strömen, wo es sich so schnell wie möglich verflüssigt. Nehmen Sie die Probenhalterung mit einer feinen Pinzette auf und tauchen Sie sie einige Sekunden lang in das Flüssiggas im ersten Gefäß.

Dann schnell in das zweite Vorratsgefäß mit flüssigem Stickstoff umfüllen. Sobald die Proben eingefroren sind, lagern Sie sie unter flüssigem Stickstoff, bis sie in die Gefrierbruchanlage überführt werden können. Legen Sie die Goldprobenstummel in einen Broschürentyp, einen Doppelreplik-Probenhalter oder eine Klemmvorrichtung unter flüssigen Stickstoff und halten Sie sie dort, bis sie in der Probenkammer positioniert werden können.

Wenn die Kammer ein Hochvakuum erreicht hat und der Tisch auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff gebracht wurde, schalten Sie die Pumpe aus, biegen Sie die Kammer und positionieren Sie die montierten Probenstummel so schnell wie möglich auf dem Probentisch. Schalten Sie dann die Pumpe ein, stellen Sie das Hochvakuum wieder her und stellen Sie mit der elektronischen Tisch- und Armtemperaturregelung die Temperatur des Probentisches auf minus 100 Grad Celsius ein. Leiten Sie auch flüssigen Stickstoff zum Mikrotomarm, um ihn auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff zu bringen.

Bei Erreichen eines Hochvakuums wird bei einer Tischtemperatur von minus 100 Grad Celsius und dem Mikrotomarm bei Flüssigstickstofftemperatur der doppelte Probenhalter aus der Ferne geöffnet, wodurch die Proben auf den Probenhalterungen gebrochen werden. Proben können geätzt werden, um die zugrunde liegenden Merkmale nach dem Bruch sichtbar zu machen. Um eine Ätzung zu erreichen, verwenden Sie eine Rasierklinge, die in einer Klemme am Mikrotomarm gehalten wird, um die Oberfläche der Proben zu rasieren. Positionieren Sie den kühlen Mikrotomarm für ein bis mehrere Minuten über den gebrochenen Oberflächen, um das Wasser zu sublimieren und echte Zelloberflächen, extrazelluläre Matrix und/oder molekulare Anordnungen freizulegen.

Aktivieren Sie als Nächstes das Platinkohlenstoff-Elektron oder die Widerstandspistole und lassen Sie es eine dünne Schicht aus Platinkohlenstoff aus einem Winkel von 30 Grad bis 45 Grad über die gebrochene Oberfläche verdampfen. Dies erfordert in der Regel etwa 15 bis 20 Sekunden, aktiviert das Kohlenstoffelektronen oder die Widerstandskanone auf die gleiche Weise und verdampft eine dünne Kohlenstoffschicht direkt von oben in einem Winkel von 90 Grad auf die gebrochene Probenoberfläche, um der Replik Halt zu geben. Dies dauert in der Regel auch etwa 15 bis 20 Sekunden nach Abschluss der Replikation, der Abschattung und der Kohlenstoffstabilisierung.

Schalten Sie die Vakuumpumpe und die Kammer aus und entfernen Sie die Probenhalterung vom Instrument. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette jeden Goldprobenstummel aus der doppelten Replik-Booklet-Klemme und lassen Sie ihn einige Sekunden lang auftauen, bevor Sie den Stummel vorsichtig auf eine Wasseroberfläche in einer Spotplatte absenken. Manövrieren Sie die Repliken entweder mit einer feinen Drahtschlaufe oder einem herkömmlichen Kupferelektronenmikroskopgitter, das von einer feinen Pinzette gehalten wird, und übertragen Sie sie für ein bis mehrere Stunden auf eine andere Punktplatte, die 5 % Natriumdichromat in 50 % Schwefelsäure enthält. In diesem Bad wird das eigentliche biologische Probenmaterial aus der Replik verdaut.

Wenn der Aufschluss abgeschlossen ist, bringen Sie die Replik zurück auf eine saubere Wasseroberfläche und entnehmen Sie sie auf ein Standard-Kupferelektronenmikroskopiegitter. Bewahren Sie Replik-Stützgitter in handelsüblichen Gitterboxen auf, wo sie jahrelang stabil bleiben. Bei schonender Handhabung oder ultrastruktureller Untersuchung von Gefrierbruch-Ätzrepliken können Repliken in einem Transmissionselektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung, typischerweise von 50 bis 80 Kilovolt, betrachtet werden.

Nehmen Sie die relevanten Bilder auf einem Standard-TEM-Film oder mit einer hochauflösenden Digitalkamera auf, die sich in der Zellmembran an der Basis jedes Eukaryoten befindet. Zilien und Flagellum sind ein Array von membranassoziierten Partikeln, die in Strängen ENC organisiert sind, die den Schaft des Ziliums umkreisen und als Ziliarkette bekannt sind. Spezialisierte Membranpartikel-Arrays erscheinen an der luminalen Grenze von Epithelzellen, die sich der Clio-Genese unterziehen.

Diese Partikelarrays stellen entstehende Ziliarketten dar, die sich an der Basis der entstehenden und reifen Celia befinden. In verschiedenen Studien zur epithelialen Gefrierfraktur zeigt sich eine ausgeklügelte Organisation von anastomosierenden Strang- und Rillenstrukturen, die den apikalen Aspekt der basolateralen Grenzen umgeben. Die Fraktur durch die Epithelzellmembranen zeigt Plasmafrakturflächen von Tight Junctions, die als Stränge erscheinen, während die extrazellulären Frakturflächen komplementäre Rillen aufweisen.

Gap Junctions treten in Gefrierfrakturpräparationen einer Vielzahl von Geweben auf und werden durch dichte Arrays von Partikeln auf Plasmafrakturflächen und komplementäre Vertiefungen auf extrazellulären Frakturen dargestellt. Die hier gezeigten Flächen sind ein Beispiel für das schnelle Einfrieren mit Tiefenätzen und rotativer Abschattung. Die Epithelzelle wurde durch das Zytoplasma gebrochen und hinter den Pfeilspitzen ist eine Plasmafrakturfläche zu sehen.

Eine echte Zelloberfläche, die durch anschließendes Ätzen sichtbar wird. Einmal gemeistert. Diese Technik kann in einem etwa dreistündigen Zyklus durchgeführt werden und bei richtiger Durchführung ein bis drei Proben liefern. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die einzelnen Schritte stark voneinander abhängig sind und dass ein Fehler in einem Schritt dazu führen kann, dass das Ergebnis nach seiner Entwicklung nicht mehr untersucht und bewertet werden kann.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Zell- und Molekularbiologie den Weg, um zu erforschen, wie genetische Mutationen strukturelle Anomalien in Zellen hervorrufen, und zwar auf eine Weise, die pathologische Zustände und Krankheiten hervorruft.