Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Virus-Konzentration durch Quantifizierung infektiöser Virionen mittels Zählung diskreter Plaques in Zellkultur zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen ausplattiert werden, um eine konfluente Monoschicht für die Infektion zu bilden. Der zweite Schritt besteht darin, eine serielle Verdünnung der unbekannten Virusprobe durchzuführen, deren Konzentration bestimmt werden soll. Anschließend werden die konfluenten Monoschichten mit der seriellen Verdünnung des Virus-Stocks infiziert, gefolgt von der Applikation einer immobilisierenden Überlagerung. Der letzte Schritt besteht darin, die Plaques nach der jeweils geeigneten Inkubationszeit für das betreffende Virus zu fixieren und anzufärben, um die diskreten Plaques zählen zu können. Letztendlich können Plaque-Assays auf verschiedene Weise verwendet und modifiziert werden, um die Virus-Titer einer unbekannten Virusprobe zu bestimmen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der halbfesten Abdeckung, liegt darin, dass die Anwendung und Entfernung sowohl bei Hochdurchsatz- als auch bei herkömmlichen Anwendungen weitaus einfacher ist. Außerdem ist keine Erhitzung der Reagenzien erforderlich. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Forschung an zahlreichen verschiedenen lytischen Viren, da die Verwendung einer flüssigen Abdeckung im 96-Well-Format eine schnelle Untersuchung neuartiger therapeutischer Substanzen ermöglicht, wodurch die langen Arbeitszeiten im Labor bei der Durchführung traditioneller Plaque-Assays erheblich reduziert werden können.

Am Tag vor dem Assay die geeigneten Zellen für das betreffende Virus so ansäen, dass sie am Tag der Infektion eine Konfluenz von 90 bis 100 % erreichen. Die Stammlösungen können ebenfalls am Tag vor dem Assay vorbereitet werden. Zunächst eine Fixierlösung mit 10 % Formaldehyd in destilliertem Wasser herstellen, indem 5,56 Milliliter 36 %ige Formaldehyd-Stammlösung mit 14,44 Milliliter destilliertem Wasser gemischt werden. Danach die Kristallviolett-Färbung herstellen, die aus 1 % Kristallviolett in 20 % Ethanol besteht, verdünnt mit destilliertem Wasser. Als Nächstes unter sterilen Bedingungen das geeignete 2x Plaque-Medium für die verwendeten Zelltypen vorbereiten. Die Lösung durch einen 0,2-Mikron-Filter filtrieren, falls eines der Reagenzien nicht steril ist. Um eine flüssige Überlagerung für den Plaque-Assay herzustellen, 2,4 Gramm Avicel zu einem Kolben geben, der 97,6 Milliliter destilliertes Wasser enthält und mit einem Rührstab schnell gerührt wird. Die Lösung bei Raumtemperatur mischen, bis sie zu viskos für den Rührstab wird. An diesem Punkt den Kolben auf einen Kolbenshaker übertragen und 30 Minuten lang stark agitieren, um eine gleichmäßige Homogenisierung sicherzustellen. Schließlich die Lösung bei 121 Grad Celsius und 14 PSI 30 Minuten lang autoklavieren.

Und nach Beendigung des Programms verschlossen bei Raumtemperatur lagern. Für eine Agarose-Überlagerung eine 0,6 %ige Agarose-Stammlösung in destilliertem Wasser herstellen, mit einem Rührstab mischen und im Autoklaven gelöst machen. Für eine Carboxymethylcellulose-Überlagerung eine 2 %ige Carboxymethylcellulose-Lösung in destilliertem Wasser herstellen und mischen. Anschließend wie zuvor im Autoklaven sterilisieren.

Am Tag nach der Aussaat überprüfen Sie mit einem umgekehrten Mikroskop die Konfluenz und Vitalität der Zellen, bevor Sie den Assay beginnen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen eine standardmäßige zelluläre Morphologie aufweisen und eine Konfluenz von etwa 90 % erreicht ist.

Führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung der infektiösen Proben in Zellwachstumsmedium durch, wobei die Anzahl der erforderlichen Verdünnungsschritte je nach erwarteter Titer des betreffenden Virus variiert. Bereiten Sie außerdem eine nicht infizierte Kontrollprobe vor, um die Zellviabilität unabhängig zu überprüfen und die Identifizierung von Plaques zu erleichtern. Pipettieren Sie die nicht infizierte Kontrolle und die seriellen Verdünnungen in die Vertiefungen der Platte, wobei darauf geachtet werden muss, die Zellschicht nicht zu stören.

Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen des Inokulums, um die Zellen zu bedecken, und halten Sie dabei das Volumen so gering wie möglich, um den viralen Kontakt mit der Zellschicht zu maximieren. Stellen Sie die Platten in den Zellkultur-Inkubator und infizieren Sie die Zellen für 45 Minuten bis eine Stunde. Schwenken Sie die Platten alle 20 Minuten vorsichtig, um eine gleichmäßige Benetzung sicherzustellen und zu verhindern, dass die Zellschicht austrocknet.

Während der Infektion bereiten Sie die Überlagerungs-Arbeitslösung für flüssige Überlagerungen vor. Mischen Sie erwärmtes Plaque-Medium und 1,2 bis 2,4 % Avicel-Stammlösung bei Raumtemperatur im Verhältnis 1:1, um eine Arbeitslösung mit 0,6 bis 1,2 % Avicel-Überlagerungsmedium zu erhalten. Für Agarose- oder CMC-Überlagerungen mischen Sie erwärmtes Plaque-Medium mit einer Stammlösung aus entweder erhitzter 0,6 %iger Agarose oder 2 %igem CMC im Verhältnis 1:1. Anschließend 30 Minuten in ein Wasserbad bei 56 Grad Celsius stellen, um die Temperatur auszugleichen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung warm, aber nicht heiß anfühlt, um Zelltod und verminderte Virus-Titer zu vermeiden. Nach der Infektion tragen Sie die Überlagerungslösung auf die infizierten Zellschichten auf. Nach Zugabe der Überlagerung inkubieren Sie die Platten je nach zu analysierendem Virus 2 bis 14 Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Um Zellen mit einer flüssigen Überlagerung zu fixieren, gießen Sie die Avicel-Überlagerung ab oder aspirieren Sie sie, dann pipettieren Sie 10 %ige Formaldehydlösung in die Vertiefungen und fixieren Sie 30 Minuten bis über Nacht bei Raumtemperatur. Bei Agarose oder CMC geben Sie die Formaldehydlösung direkt zur Überlagerung hinzu und lassen sie eine Stunde bis über Nacht bei Raumtemperatur einwirken. Nach der Fixierung entsorgen Sie die Formaldehydlösung und entfernen anschließend manuell die halbfesten Plugs der Agarose mit dem Spatel.

Spülen Sie die Avicel-Zell-Plaques mit Wasser, um restliches Überzugshistofixativ vor der Färbung zu entfernen.

Die Zellen mit einer geringen Menge Kristallviolett-Lösung für etwa 15 Minuten einfärben. Gegebenenfalls die Platten schwenken, um eine gleichmäßige Bedeckung sicherzustellen. Die Kristallviolett-Färbung vorsichtig mit Wasser abwaschen. Nach dem Fixieren, Färben und Trocknen können die Plaques unbegrenzt für zukünftige Analysen aufbewahrt werden. Die Plaques in jedem Wells zählen, wobei Wells mit weniger als fünf oder mehr als 100 Plaques nicht berücksichtigt werden. Den Mittelwert für technische Replikate derselben Verdünnung bilden. Plaque-Größe und -Morphologie notieren. Die Virus-Titer der Stammlösung bestimmen, indem die durchschnittliche Anzahl der Plaques für eine Verdünnung mit dem Kehrwert des Gesamtverdünnungsfaktors multipliziert wird.

Dieses Bild zeigt Plaque-Überlagerungsvergleiche des Rift-Valley-Fieber-Virus unter Verwendung von 12-Loch-Platten. Vero-Zellen wurden mit 2,5 × 10⁵ Zellen pro 12-Loch-Platte ausgesät und mit 200 µL derselben seriell verdünnten Startprobe des MP-12-Virus infiziert. Nach der Infektion wurden 1,5 mL Überlagerungen aus 0,3 % Agarose, 0,6 % Avicel oder 1 % CMC aufgebracht, um die Überlagerungen direkt zu vergleichen. Dieses Histogramm zeigt die Ergebnisse der Plaque-Zählungen und Titrierungen für alle drei Überlagerungen. Hier werden Plaque-Überlagerungsvergleiche mit VEEV unter Verwendung von 12-Loch-Platten dargestellt. Die Vero-Zellen wurden wie zuvor ausgesät und mit einem Volumen von 200 µL derselben seriell verdünnten Startprobe des VEEV-TC-83-Impfstammes infiziert; nach der Infektion wurden erneut 1,5 mL Überlagerungen aus 0,3 % Agarose, 0,6 % Avicel-Zell oder 1 % CMC aufgebracht.

Auch hier zeigt das Histogramm die Ergebnisse der Plaquezählungen und der Titrierung für alle drei Überlagerungen. Dieses Bild zeigt ein Beispiel für Hochdurchsatz-Plaque-Überlagerungen. Eine 96-Loch-Platte mit Veros, die mit dreimal 10 hoch vier Zellen pro Loch beimpft wurden, wurde mit 50 µL Inokulum unter Verwendung derselben seriell verdünnten Startprobe des Rift-Valley-Fieber-Virus MP 12 vierfach infiziert. Für die Überlagerungen wurden endgültige Konzentrationen von 0,6 und 1,2 % Avicel-Zellulose getestet, um die Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit der Verwendung flüssiger Überlagerungen im Hochdurchsatzverfahren zu bestimmen. Dieses Histogramm zeigt die aus jeder Überlagerung ermittelten Titer.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass sich jeder Virus unterscheidet und Optimierungen erforderlich sein können, beispielsweise durch die Verwendung verschiedener Zelltypen, Inkubationszeiten und/oder Wachstumsmedien. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen grundlegenden Plaque-Assay unter Verwendung von flüssigen und halbfesten Überlagerungen durchführt.