Imaging Ca ²⁺ Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, durch Lichtreize evozierte Kalziumsignale von Zapfen-Photorezeptoren in der Netzhaut der Maus mit Hilfe eines fluoreszierenden Biosensors aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem die Netzhaut aus einer transgenen Mauslinie isoliert wird, die genetisch kodierte Kalziumsensoren ausschließlich in den Zapfen-Photorezeptoren exprimiert. Der zweite Schritt besteht darin, vertikale Scheiben des Netzhautgewebes zu schneiden.

Anschließend werden die Netzhautschnitte auf die Deckgläser aufgesetzt und unter ein Zwei-Photonen-Mikroskop gelegt. Der letzte Schritt besteht darin, Kalziumsignale von den einzelnen synaptischen Enden der Zapfen-Photorezeptoren als Reaktion auf Lichtstimulation aufzuzeichnen. Letztendlich werden die aufgezeichneten Kalziumsignale offline analysiert.

Mit dieser Methode können wir die Aktivität vieler Rezeptoren in Maisnahrung gleichzeitig in subzellulärer Auflösung erfassen. Dies ist der Hauptvorteil gegenüber bestehenden Techniken wie elektrischen Einzelzellaufzeichnungen, die schwieriger und zeitaufwändiger sind. Die Frage, die wir beantworten möchten, ist also, ob und wie Kalzium an der Degeneration von Photorezeptoren beteiligt ist.

Mit dieser Methode können wir feststellen, ob der Kalziumeinstrom die Degeneration der Photorezeptoren vorantreibt oder ob er eine Folge der Tatsache ist, dass die Zelle stirbt. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, vor allem, weil die lichtempfindliche Netzhaut wöchentlich erhalten werden muss und daher alle heiklen Schritte, einschließlich Netzhaut, Dissektion und Scheibenionen, unter grün-rotem Licht durchgeführt werden müssen. Um diesen Vorgang zu starten, übertragen Sie einen Mausaugapfel in eine Petrischale, die frisch gepresste, sauerstoffhaltige extrazelluläre Lösung enthält.

Durchstechen Sie den Augapfel an einer beliebigen Stelle entlang der Grenze zwischen Hornhaut und Sklera mit einer scharfen Injektionsnadel. Halten Sie dann das Auge mit einer Pinzette an die Sklera und führen Sie vorsichtig eine Scherenklinge in das Loch ein. Schneide entlang der Aura serrata, um den vorderen Teil des Auges von der Augenmuschel zu trennen.

Schneiden Sie anschließend die Augenmuschel radial an der Position der Stiftmarkierung ein, um die dorsale Position auf der Netzhaut anzuzeigen. Positionieren Sie dann die Augenmuschel so, dass der dorsale Schnitt nach weg zeigt. Fassen Sie die Sklera auf der linken und rechten Seite der Augenmuschel, indem Sie die Pinzettenspitzen zwischen Netzhaut und Sklera einführen.

Anschließend lösen Sie die Netzhaut ab, indem Sie den skleralen Teil der Iica vorsichtig umdrehen. Zum Schluss durchtrennen Sie den Sehnerv, um die Netzhaut von der Sklera zu befreien. Halten Sie den Rand der Netzhaut mit einer Pinzette fest und entfernen Sie mit einer zweiten Pinzette vorsichtig Ablagerungen und Glaskörper von der Netzhautoberfläche.

Wenn die Netzhautoberfläche sauber ist, machen Sie drei weitere kürzere radiale Schnitte. Tauchen Sie nun langsam einen Objektträger in die extrazelluläre Lösung in der Nähe des Gewebes. Ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig mit der Ganglienzellseite nach oben auf den Objektträger, indem Sie den Rand greifen, um mechanische Beschädigungen und Falten des Gewebes zu reduzieren.

Schneiden Sie anschließend ein Rechteck von etwa einem mal zwei Millimetern aus der ausgewählten Netzhautregion heraus und wischen Sie mit einer gebogenen Skalpellklinge die überschüssige Lösung um das Gewebe herum ab. Legen Sie dann die vorbereitete Nitrozellulosefasermembran so auf das Netzhautstück, dass die Seite der Ganglienzellen an der Membran haftet. Geben Sie sofort einen Tropfen extrazelluläres Medium auf die Membran, um das Gewebe fest daran zu befestigen.

Übertragen Sie das membranmontierte Netzhautgewebe in die Schneidekammer mit frischer extrazellulärer Lösung. Schneiden Sie dann die Netzhaut in vertikale Scheiben von 200 Mikrometer Dicke. Mit einem Gewebehäckslerkleber wird eine einzelne Membranscheibe auf einem Glasdeckglas befestigt, die mit Hochvakuumfett vorbereitet ist.

Halten Sie die Glasoberfläche unterhalb der Netzhaut und fettfrei. Geben Sie danach einen Tropfen extrazelluläre Lösung auf jede auf dem Deckglas montierte Scheibe in der Haltekammer bei Raumtemperatur. Führen Sie Carbogen in die Kammer ein, indem Sie ein kleines Wasserreservoir sprudeln lassen und die Atmosphäre in der Warmhaltekammer halten. Befeuchtet.

Lassen Sie die Scheiben 10 bis 15 Minuten in der Haltekammer ruhen, bevor Sie sie nacheinander in die Aufnahmekammer übertragen. Übertragen Sie eine Scheibe aus der Warmhaltekammer in die Aufnahmekammer und beginnen Sie sofort mit der Perfusion mit einer kohlensäurehaltigen extrazellulären Lösung. Halten Sie eine Perfusionsflussrate von zwei Millilitern pro Minute und eine Temperatur von 37 Grad Celsius aufrecht.

In der Aufnahmekammer. Verwenden Sie ein 20 x 0,95 NA Wasserimmersionsobjektiv und eine CCD-Kamera in Kombination mit einer Infrarot-LED unterhalb der Aufnahmekammer. Um die Netzhautscheibe zu lokalisieren, starten Sie das Zwei-Photonen-Bildgebungssystem wie vom Hersteller angegeben.

Schalten Sie als Nächstes den Laser ein und stellen Sie ihn auf 860 Nanometer ein. Schalten Sie die beiden Detektionskanäle für die Fluoreszenzbildgebung von ECFP und Citrin ein. Steuern Sie anschließend mit der Bilderfassungssoftware das Zwei-Photonen-Mikroskop, um eine Reihe von Zapfenanschlüssen für die Aufzeichnung zu scannen und auszuwählen. Stellen Sie die Bildaufnahme auf 128 x 16 Pixel Bilder oder eine ähnliche Konfiguration ein. Beschränken Sie den gescannten Bereich auf die Kegelanschlüsse, um ein Ausbleichen von Fotopigmenten in den äußeren Segmenten zu vermeiden.

Schalten Sie den Laser ein. Lassen Sie die Zapfen 20 bis 30 Sekunden lang an den Scanning-Laser und das Stimulus-Hintergrundlicht anpassen, bevor Sie Lichtreize präsentieren oder pharmakologische Wirkstoffe auftragen. Beginnen Sie nun mit der Darstellung der beliebigen Reize.

Die Reize werden erzeugt, indem die Intensität der beiden LEDs über die Zeit moduliert wird, wobei eine Mikroprozessorplatine verwendet wird, die von einer kundenspezifischen Software gesteuert wird. Starten Sie dann die gleichzeitige Aufnahme der beiden Fluoreszenzkanäle mit der jeweiligen Bildaufnahmesoftware. Die Aufnahmen konzentrierten sich auf die synaptischen Enden der Zapfen-Photorezeptoren in den Netzhautschnitten.

Dies ist ein Beispiel für einen aufgezeichneten Bereich mit sieben einzelnen Anschlüssen. Die Fluoreszenz wurde mit zwei Kanälen aufgezeichnet, einem für das Fre-Zepter-Citrin und einem für den Bunddonor. ECFP. Gezeigt. Hier sind die lichthervorgerufenen Veränderungen der Citrin- und ECFP-Fluoreszenz, die in einer einzigen interessierenden Region aufgezeichnet wurden.

Und hier sind die Kalziumreaktionen eines Kegelterminals auf eine Reihe von einsekündigen hellen Lichtblitzen in Fünf-Sekunden-Intervallen. Diese Abbildung zeigt die beispielhafte quantitative Analyse von lichtevozierten Zapfen-Kalzium-Reaktionen. Und hier sind die lichtevozierten Kalziumreaktionen von einem einzigen Kegelterminal.

Diese Abbildung zeigt die Bestimmung der mittleren Calciumreaktion. Der Ruhe-Calciumspiegel stellt die Ausgangslinie vor der Lichtstimulation dar, und die Reaktionsgröße ist ra, d. h. der Bereich zwischen dem Ruhe-Calciumspiegel und der Spitzenamplitude sowie zwischen der Kinetik des Reaktionsbeginns und des Offsets. Dieses Verfahren kann noch erweitert werden.

Zum Beispiel können Photorezeptor-Kalziumsignale unter verschiedenen pharmakologischen und großen Stimulationsbedingungen wichtig sein, um wie die Anpassung zu untersuchen oder verschiedene Schritte der Phototransduktion im Detail zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es, die Kalziumdynamik in Zapfen-Photorezeptoren unter normalen physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Dies ist besonders relevant für das Verständnis der Degeneration primärer und sekundärer Zapfen-Photorezeptoren bei menschlichen Erblindungskrankheiten wie Acrotopia oder Retinitis pigmentosa.