Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neuronale Stammzellen aus der paraventrikulären Region des erwachsenen Ratten- oder menschlichen Rückenmarks zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Rückenmark mittels Laminektomie entnommen wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Rückenmark quer in ein Zentimeter lange Segmente zu schneiden und die paraventrikuläre Region aus jedem Segment des Rückenmarks zu präparieren.

Anschließend wird das zerkleinerte Gewebe in Stücke von einem Millimeter Größe geschnitten und anschließend enzymatisch dissoziiert. Im letzten Schritt werden intakte Zellen durch Zentrifugation über ein diskontinuierliches Dichtegradienten getrennt und die Zellsuspension aufgeplattet. Letztendlich kann die Bildung von Neurosphären und das Wachstum von neuronalen Stammzellen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie bewertet werden.

Heute werde ich demonstrieren, wie man neuronale Stammzellen aus der paraventrikulären Region des erwachsenen Ratten-Rückenmarks isoliert. Diese Zellen können anschließend genutzt werden, um zentrale Fragen im Bereich der neuronalen Stammzellen zu beantworten, beispielsweise welche exogenen Faktoren die Linienrestriktion fördern oder wie diese Zellen auf verschiedene Reize oder Stresssituationen reagieren. Beginnen Sie damit, die Kultur, das Medium und die Puffer für die Dissektion gemäß der beigefügten Textanleitung vorzubereiten.

Anschließend, nach einer Überdosierung des Anästhetikums, desinfizieren Sie die Haut der Ratte und entfernen mithilfe großer Dissektionscheren die Rückenseite, um die Wirbelsäule freizulegen. Halten Sie die Dissektionscheren senkrecht zur Rückenseite und quer ausgerichtet. Durchtrennen Sie die Wirbelsäule oberhalb der Hintergliedmaßen.

Verwenden Sie dann kleinere Scheren, um den über der Wirbelsäule liegenden dorsalen Muskel in rostraler Richtung längs aufzuschneiden, um die Dornfortsätze freizulegen, beginnend am freigelegten Coddle-Ende. Führen Sie ein kleines stumpfes Knochenschneidinstrument extraoral von der Seite in den Zwischenraum zwischen Rückenmark und Wirbelsäule im Bereich des Wirbelkanals ein. Platziere die Klinge flach und parallel zum Rückenmark.

Danach kleine Einschnitte in die Lamina vornehmen und die Lamina vorsichtig abziehen, um das Rückenmark freizulegen. Dieser Winkel verhindert eine Beschädigung des darunterliegenden Rückenmarks. Die Entfernung der Lamina in zephaler Richtung fortsetzen.

Um das thorakale und zervikale Rückenmark freizulegen, heben Sie es vorsichtig mit stumpfen Gewebetupfern vom Wirbelkanal ab und durchtrennen Sie die Wurzeln mit einer Mikroschere. Um das Rückenmark zu lösen, legen Sie das entfernte Rückenmark in eine Petrischale, die eiskalten, sterilen Ratten-Dissektionspuffer enthält. Spülen Sie das Gewebe mit dem eiskalten Dissektionspuffer ab und schneiden Sie das Rückenmark mit einer Schere quer in ein Zentimeter lange Segmente. Für jedes Gewebestück halten Sie dieses mit einer Hand mit feinen Pinzetten fest und entfernen Sie mit der anderen Hand mit einer Mikroschere vorsichtig die weiße Substanz zusammen mit dem Großteil der grauen Substanz, sodass nur noch der periventrikuläre Bereich des Rückenmarks verbleibt.

Ziehen Sie das dissektierte periventrikuläre Gewebe in eine 10 Zentimeter große sterile Petrischale mit eiskaltem Ratten-Dissektionspuffer. Um die Isolierung von neuronalen Stammzellen aus der Ratte zu beginnen, zerkleinern Sie das dissektierte periventrikuläre Gewebe mit einer Mikroschere zu Stückchen von je einem Kubikmillimeter. Bereiten Sie anschließend den enzymatischen Dissoziationspuffer vor, indem Sie zunächst fünf Milliliter Earl’schen Puffer mit ausgeglichener Salzlösung zu einem Röhrchen mit Papain aus einem Papain-Dissoziationskit hinzufügen.

Stellen Sie das Gefäß 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit die Papain vollständig gelöst wird und die Lösung klar erscheint. Geben Sie anschließend 500 µL Earl’schen Pufferlösung (Earl’s balanced salt solution) zu dem Gefäß mit der DNA aus dem Dissoziationskit. Vorsichtig mischen, dann 250 µL der DNA-Lösung zu dem Gefäß mit Papain geben und erneut vorsichtig mischen.

Fügen Sie als Nächstes das zerkleinerte Gewebe, etwa 0,2 Gramm, in das Gefäß hinzu und stellen Sie das Gefäß für 45 Minuten bis eine Stunde auf eine Wipplattform bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation pipettieren Sie die Mischung mit einer 10-Milliliter-Pipette um, um verbleibende Gewebestücke aufzulösen, wodurch eine trübe Zellsuspension entsteht. Überführen Sie die Zellsuspension in ein steriles 15-Milliliter-Kegelrohr und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 300 G.

Bei Raumtemperatur während der Zentrifugation bereiten Sie die OVO-Moid-Lösung vor, indem Sie 2,7 Milliliter Earl’s Balanced Salt Solution mit 300 Mikrolitern der rekonstituierten Albumin-OVO-MOID-Inhibitor-Lösung mischen. Geben Sie in einem 15-Milliliter-Konischkolben 150 Mikroliter der zuvor hergestellten DNA-Lösung zur Oval-Moid-Lösung hinzu und mischen Sie durch Vorsichtiges Umstülpen des Kolbens. Entsorgen Sie den Überstand der pelletierten Zellen und resuspendieren Sie das Zellpellet unverzüglich in der verdünnten DNA-Albumin-Inhibitor-Mischung. Bereiten Sie als Nächstes ein diskontinuierliches Dichtegradienten vor, indem Sie fünf Milliliter der Albumin-Inhibitor-Lösung in einen 15-Milliliter-Kolben geben und die Zellsuspension vorsichtig und langsam mit einer 5-Milliliter-Pipette auf die Albumin-Inhibitor-Lösung aufschichten.

Zentrifugieren Sie die Probe sechs Minuten lang mit 70 ×g bei Raumtemperatur. Danach entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in einem Milliliter vorgewärmtem Ratten-EFH-Medium, das gemäß der im begleitenden Textprotokoll beschriebenen Methode hergestellt wurde. Bestimmen Sie die Dichte lebender Zellen mit einem Hämozytometer und impfen Sie die Zellen in einem T25-Kulturgefäß mit einer Dichte von 10 Zellen pro Mikroliter in EFH aus.

Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid und lassen Sie die Kulturen eine Woche lang ungestört wachsen, um eine Aggregation der Sphäroide zu vermeiden. Gezeigt ist ein Querschnitt des Ratten-Rückenmarks, der mit Luxol Fast Blue sowie Hämatin und Eosin gefärbt wurde, um die Grenzen von weißer und grauer Substanz sichtbar zu machen. Die gestrichelte Linie kennzeichnet das dissektierte verbleibende periventrikuläre Gewebe, das in diesem Protokoll aus diesem Bereich isoliert wurde.

Neurosphären wie die hier gezeigten wachsen bei hoher Vergrößerung schwimmend in Suspension. Mikrospitzen sind sichtbar, die von den Neurosphären hervorstehen, und die Proliferation der Neurosphären zeigt sich durch KI-67-positive Färbung, wobei die Neurosphären dissociiert und auf mit Matrigel beschichteten Platten angezüchtet wurden. Zusätzlich exprimieren sie überwiegend Nestin, ein Marker für neuronale Vorläuferzellen.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können der Kultur der Zellen exogene Faktoren hinzugefügt werden, um die Differenzierung zu fördern. Die adulten neuronalen Stammzellen oder ihre Tochterzellen können zudem in verschiedene Tiermodelle transplantiert werden, um ihre Fähigkeit zur regenerativen Reparatur zu untersuchen. Ich hoffe, dieses Video ist für Sie hilfreich, und wünsche Ihnen viel Erfolg bei Ihren Experimenten.