Isolierung und Charakterisierung von Satellitenzellen aus Ratte Kopf Branchiomeric Muscles

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Satellitenzellen aus repräsentativen Muskeln, die aus dem ersten, zweiten und vierten Armbogen stammen, für ihre Kultur auf einer extrazellulären Matrix zu isolieren. Gel-Flecken. Dies wird erreicht, indem zunächst die Massaker-, Digastric- und Levada-vli-Gaumenmuskeln einer jungen erwachsenen Ratte seziert werden.

Im zweiten Schritt werden die Satellitenzellen aus jeder Muskelprobe nach Enzymatik, Verdauung und Dauer isoliert. Die Zellen werden dann auf den extrazellulären Matrixgelen kultiviert. Letztendlich kann der dynamische Zustand der Myogenese der Satellitenzellkulturen durch Färbung der interessierenden Muskelmarker verfolgt werden.

Die Lippen-Kiefer-Gaumenspalte ist eine der häufigsten c-kraniofazialen Fehlbildungen beim Menschen. Wenn eine Spalte vorliegt, ist eine chirurgische Reparatur erforderlich, um den Defekt zu schließen und eine normale Sprachentwicklung zu ermöglichen. Fibrose und defekte Muskelregeneration können jedoch die funktionelle Wiederherstellung der weichen Gaumenmuskulatur behindern. Nach der Reparatur einer Gaumenspalte können Sie eine innovative Methode zur Kultivierung frisch isolierter Satellitenzellen mit exozellulären Matrix-Gel-Spot-Beschichtungen von nur einem Millimeter Größe demonstrieren.

Dadurch wird die Notwendigkeit einer Erweiterung vermieden. Einen Tag vor der Isolierung werden acht Vertiefungskammern in eine 100-Millimeter-Petrischalen gegeben und auf eine kalte Oberfläche gebracht. Verwenden Sie nach 10 Minuten eine vorgefüllte Mikropipette, um einen einzelnen Tropfen extrazelluläres Matrixgel von 10 Mikrolitern in jede Vertiefung zu geben.

Nachdem Sie die Objektträger weitere sieben Minuten gekühlt haben, entfernen Sie das restliche Gel vollständig und trocknen Sie die Vertiefungen am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius. Um den Massaker-Muskel zu sezieren, entferne die Haut vom Kopf einer neun Wochen alten Ratte und fixiere den Kopf mit Injektionsnadeln auf der Seite. Isolieren Sie auf einem Silikonpad die Ohrspeicheldrüse und den Gesichtsnerv und entfernen Sie die Drüse.

Entfernen Sie anschließend mit einer Skalpellklinge Nummer 15 vorsichtig den Gesichtsnerv. Identifiziere den oberflächlichen Kopf des Kaumuskels. Trennen Sie anschließend mit einer geraden Pinzette die Sehne am Jochbeinfortsatz von ihrem Ursprung, gefolgt von einem vorsichtigen Schneiden der Sehne mit einer Präparierschere.

Präparieren Sie mit dem Skalpell den oberflächlichen Kopf des Massakers bis zu seinem Einstich in den Winkel und die untere Hälfte der Seitenfläche des Ramus des Unterkiefers. Um den hinteren Bauch des Musculus digastricus zu präparieren, fixieren Sie den Kopf mit Nadeln in Rückenlage und entfernen Sie das Unterhautfett, das sowohl über der sublingualen als auch der submandibulären Drüsen liegt. Legen Sie den vorderen und hinteren Magenmuskelbauch frei, halten Sie dann die vordere Sehne des hinteren Bauches mit einer geraden Zange fest, schneiden Sie die Sehne vorsichtig bis zu ihrem Ursprung im Tympanic Buller ab.

Um den Musculus levada vli palatino zu disparieren, lokalisieren Sie den Musculus stylo halloide. Ziehe ihn seitlich und entferne vorsichtig das Muskelgewebe. Als nächstes lokalisieren Sie die Sehne der Levada vli Palatino, die den Paukenbuller einsetzt, und präparieren Sie sie sorgfältig.

Heben Sie dann die Speiseröhre hinter der Luftröhre hervor. Identifizieren Sie den Bereich des weichen Gaumens, in den die Levada vli Gaumen eingeführt wird, und schneiden Sie den Muskel los. Tauchen Sie dann den Muskel in 70%iges Ethanol und geben Sie es in eiskaltes PBS, das mit Antibiotika ergänzt wird.

Um die Satellitenzellen zu isolieren, übertragen Sie jeden Muskel in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte und schneiden Sie das Gewebe in kleine zwei Millimeter große Stücke. Darauf achten, dass die Muskeln nicht zu sehr zerkleinert werden. Inkubieren Sie anschließend die Gewebefragmente vorsichtig in 2,5 Millilitern 0,1%iger Pronaselösung pro Vertiefung bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten und schütteln Sie sie alle 20 Minuten leicht.

Wenn die Faserbündel ein gelockertes Erscheinungsbild aufweisen, werden 2,5 Milliliter DMEM, ergänzt mit Pferdeserum und Antibiotika, in jede Vertiefung gegeben und das verdaute Gewebe auf einzelne konische 15-Milliliter-Röhrchen übertragen. Schleudern Sie die Gewebeschlämme herunter und dekantieren Sie die Überstände. Geben Sie dann fünf Milliliter Medium in jedes Röhrchen und homogenisieren Sie das Gewebe mit einer 10-Milliliter-Kunststoffpipette.

Schleudern Sie das Gewebe wieder herunter und überführen Sie die Überstände in neue konische 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann fünf weitere Milliliter Medium in die Röhrchen und tri raten Sie die Gewebestücke erneut, bis die Fragmente leicht durch die Pipette passen. Nach einer weiteren Zentrifugation ziehen Sie die Überstände in die entsprechenden Röhrchen und filtrieren die Zellsuspensionen durch 40-Mikrometer-Siebe in einzelne 50-Milliliter-Röhrchen.

Waschen Sie die Siebe mit einem Milliliter DMEM, um eine maximale Zellrückgewinnung zu erzielen. Schleudern Sie dann die Zellen herunter, resuspendieren Sie die Pellets in frischem, mittlerem Zustand und zählen Sie die Zellen, um die isolierten Satellitenzellen zu kultivieren. Als nächstes verdünnen Sie die Zellsuspensionen auf 1,5 mal 10 auf die drei Zellen pro 10 Mikroliter Kulturmedium.

Geben Sie dann 10 Mikroliter Zellen auf jeden zuvor vorbereiteten extrazellulären Matrix-Gel-Spot und inkubieren Sie die Gele nach sechs Stunden bei 37 Grad Celsius. Geben Sie vorsichtig 400 Mikroliter Nährmedium auf jeden Gelfleck und geben Sie die Objektträger wieder in den Inkubator. Nach drei Tagen wird die Differenzierung der Zellen unter Zugabe des entsprechenden Kulturmediums unmittelbar nach der Isolierung eingeleitet.

Mehr als 90 % der frisch isolierten Satellitenzellen exprimieren das siebte Pack Am vierten Tag werden das siebte Pack und das MyoD von den Satellitenzellen aus allen Muskelgruppen exprimiert. Mein OG wird am siebten Tag in allen Muskelgruppen stark exprimiert. Vier Tage nach der Aussaat auf der extrazellulären Matrix, den Gelflecken, beginnen die proliferierenden Zellen zu verschmelzen und kleine mehrkernige Myoröhrchen zu bilden, die an Tag sieben und 10 die Myosin-Schwerkette exprimieren.

Lange und gut organisierte Myo-Eileiter sind am 10. Tag sichtbar. Auch ein Zucken der Myo-Röhre kann beobachtet werden. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Satellitenzellen, die aus der Kopfmuskulatur stammen und bietet neue Möglichkeiten für die Behandlung von Palspalten. Patienten.