Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Verkapselung einer thermogenen katabolen Zelllinie und ihre Anwendungen in vitro und möglicherweise in vivo zu demonstrieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine Natriumalginat-Zellsuspension vor und übertragen Sie sie in eine Fünf-Milliliter-Spritze. Der nächste Schritt besteht darin, die Alginat-Mikrokügelchen mit einer Verkapselungsvorrichtung herzustellen.

Die Mikrokügelchen werden dann mit einer polyonischen Poly-L-Lysinlösung beschichtet, und der Alginatkern wird anschließend entfernt, um eine semipermeable Membran um eine Zellsuspension zu bilden. Der letzte Schritt besteht darin, die verkapselten Zellen mit anderen Zelllinien zu co-kultivieren oder in das Fettgewebe von Mäusen zu injizieren. Letztendlich zeigt die Immunblutanalyse eine höhere lipolytische Aktivität in Adipozyten, die mit Aldehyddehydrogenase konkultiviert wurden, einem Mangel an Adipozyten, der Mikrokappen enthält.

Während die Immunhistochemie die erfolgreiche Transplantation von verkapselten Zellen in das Fettgewebe von Mäusen zeigt, kann diese Methode Einblicke in die Thermogenese und das Apusgewebe geben. Es kann auch auf andere bestehende Tiermodelle angewendet werden, um ein kostengünstiges experimentelles Modellsystem für die Untersuchung von Zelluntergruppen in vivo bereitzustellen. Für biomedizinische Entdeckungen sollten alle Eingriffe in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe zwei mit laminarer Strömung durchgeführt werden.

Zu Beginn nehmen Sie das alte Medium aus dem Zellkulturkolben und spülen die Präadipozyten mit 10 Millilitern PBS aus. Entfernen Sie das PBS und resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern mit 0,25 % EDTA. Entfernen Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot aus der Zellsuspension und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

Geben Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers DMEM zu den verbleibenden Zellen, um die ideale Menge an Zellen zu erhalten, und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 480-facher G-Temperatur bei Raumtemperatur. Nachdem wir die Menge der benötigten Zellen gemäß den Anweisungen im Protokolltext bestimmt haben, suspendieren wir das Zellpellet in einem geeigneten Volumen einer 2%igen Natrium-Algin-Nettolösung. Übertragen Sie die Natriumalginat-Zelllösung in eine Fünf-Milliliter-Spritze.

Entfernen Sie alle Luftblasen in der Lösung und drehen Sie die Spritze um, um eine Ein-Milliliter-Lufttasche zu erzeugen. Zur Vorbereitung der Verkapselung wird ein kleines Becherglas mit 144 Millilitern einer 100 millimolaren Calciumchloridlösung eingesetzt. Befestigen Sie die Elektrode unter dem Nadelauslauf der Verkapselungsvorrichtung mit der Spitze etwa 2,5 Zentimeter über der Oberfläche der Calciumchloridlösung an der Verkapselung.

Legen Sie die Spritze mit der Natriumalginat-Zelllösung fest in die Spritzenpumpe. Befestigen Sie den Gummischlauch an der Öffnung der Spritze. Schieben Sie den Kolben, bis die Natriumalginat-Zelllösung auf halbem Weg durch das Rohr eintritt.

Stellen Sie die Spannung auf 5,4 Kilovolt ein und stellen Sie den Durchmesser an der Spritzenpumpe auf 12,06 Millimeter ein. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf drei Milliliter pro Stunde ein. Starten Sie die Pumpe, schalten Sie die Kapselung ein und halten Sie die Spannung auf 5,4 Kilovolt.

Schließen Sie das Fenster der Haube und vermeiden Sie unnötige Vibrationen, bis die Bildung der alginischen Mikrokügelchen abgeschlossen ist. Nachdem die gesamte Lösung die Nadel passiert hat, verfestigen Sie die alginatkugelförmigen Mikrokügelchen weitere 20 Minuten in der Calciumchloridlösung, bevor Sie sie mit polyanionischem Polylysin oder PLL beschichten. Sobald sich die kugelförmigen Mikrokügelchen der Natriumalginatzelle verfestigt haben, entfernen Sie das Becherglas mit den Mikrokügelchen aus der Verkapselungsvorrichtung.

Übertragen Sie die Mikrokügelchen in ein 50-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen. Entfernen Sie die Calciumchloridlösung aus dem Mikrokügelchen-Pellet. Waschen Sie die Mikrokügelchen, indem Sie 30 Milliliter einer 0,9%igen Natriumchloridlösung hinzufügen und das Röhrchen vorsichtig mit der Hand schütteln.

Lassen Sie die Mikrokügelchen durch die Schwerkraft ausfallen. Verwenden Sie dann eine 25-Milliliter-Pipette, um die Natriumchloridlösung auf diese Weise zu entfernen. Waschen Sie die Mikrokügelchen insgesamt dreimal.

Fügen Sie als Nächstes die 0,05%ige PLL-Lösung zu den Mikrokügelchen hinzu. Verwenden Sie 10 Milliliter PLL-Lösung für jeden Milliliter Natriumalginatlösung. Vortex mit 1000 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten, was in der Regel für eine PLL-Beschichtung ausreichend ist.

Nachdem Sie die Bildung der PLL-Schicht bestätigt haben, entfernen Sie die PLL-Lösung und waschen Sie die Kapseln dreimal mit einer 0,9%igen Natriumchloridlösung, wie zuvor gezeigt, um den alternativen Kern von den PLL-beschichteten Mikrokügelchen zu entfernen, geben Sie zuerst 30 Milliliter einer 50 Millimolaren Natriumcitratlösung in das 50-Milliliter-Röhrchen. Warten Sie fünf Minuten oder bis sich das gesamte Natriumalginat aufgelöst hat. Waschen Sie die Kapseln dreimal mit 0,9%iger Natriumchloridlösung, wie zuvor gezeigt.

Nach dem dritten Waschen bei 20 Millilitern Kulturmedium in das Röhrchentransfer werden alle Kapseln, die die Zellen in einen Zellkulturkolben enthalten, mit den verkapselten Zellen unter Standard-Zellkulturbedingungen behandelt. Die Wirtszellen für dieses Verfahren sollten in 24-Well-Platten kultiviert werden, bis sie konfluent sind. Verwenden Sie Fibroblasten-Wachstumsmedium, das wie im Begleitprotokoll beschrieben hergestellt wurde.

Text für die Kultivierung von Präadipozyten. Übertragen Sie die Mikrokappen in die 24-Well-Platte mit konfluenten Wirtszellen, fügen Sie Mikrokappen hinzu, um in jeder Vertiefung eine Monoschicht zu erreichen, und induzieren Sie die Präadipozytendifferenzierung mit der Differenzierung. Medium eins 48 Stunden inkubieren.

Ändern Sie nach 48 Stunden das Medium auf Differenzierung. Mittel. Zweitens: Ersetzen Sie die Medien durch eine frische Differenzierung. Medium.Zwei. Alle 48 Stunden werden Proteine aus den Zellen mittels Western Blot analysiert.

Jeder Schritt der Mikrokügelchenproduktion kann unter dem Mikroskop beobachtet werden. Eine Alginat-Mikrokügelchen ist bei 20-facher Vergrößerung zu sehen. Vor der PLL-Beschichtung, nach der Kodierung mit PLL und nach dem Auflösen des Ginnet-Kerns wurde in einer quantitativen Studie die Expression von Fetttriglycerid-Lipase oder A TGL zwischen drei T-, drei L-, Ein-Adipozyten, die mit azellulärer Wildtyp- oder Aldehyd-Dehydrogenase co-kultiviert wurden, einem A-, einem defizienten Adipozyten, der Mikrokappen enthält, verglichen.

Die höhere Expression von A-TGL in Adipozyten, die mit einem L-, DH-, einem A-, einem Dip-Zyten-haltigen Mikrokappen kokultiviert wurden, deutet auf eine höhere lipolytische Aktivität hin. In einer in vivo-Studie wurden GFP-markierte verkapselte Zellen in das intraabdominale Fettdepot von Mäusen injiziert. 80 Tage später wählte das injizierte Fettpolster verfärbte Cluster von verkapselten Zellen aus.

Ein in Paraffin eingebetteter Abschnitt des intraabdominalen Fettdepots, der mit Hämat, Toin und Eosin gefärbt ist, zeigt Cluster von implantierten Mikrokappen, verkapselten Zellen und Wirtsadipozyten. Derselbe Schnitt, der unter Fluoreszenzlicht analysiert wurde, zeigt GFP-markierte transplantierte Zellen auf der Innenseite von runden, intakten Kapseln. Die Expression von GFP ist auch ein Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen nach ihrer Entwicklung.

Diese Verkapselungstechnik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Stoffwechselerkrankungen den Weg, um mögliche Behandlungen für Fettleibigkeit, Insulinresistenz bei Typ-2-Diabetes, Entzündungen sowie Krebs und modale Organismen zu erforschen.