Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Anwendern zu helfen, eine Hochdurchsatz-Sammel- und Verarbeitungspipeline für die Kryo-Elektronentomographie aufzubauen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Kryo-Elektronentomorgraphie zu beantworten, wie z. B.: Wie gehe ich mit Daten um, die mit Detektoren der neuen Generation gesammelt wurden, und wie verarbeite ich eine riesige Datenmenge, die von automatisierter Tilt-Series-Erfassungssoftware erzeugt wird? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Benutzer mehrere Softwarepakete auf einheitliche Weise konfigurieren kann, um eine effiziente Pipeline für die automatisierte Tilt-Series-Verarbeitung zu finden, so dass mehr Zeit für die Tomogrammanalyse aufgewendet werden kann.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Kryo-ET sind, Schwierigkeiten haben, da viele langwierige Schritte erforderlich sind, um mit massiven Daten umzugehen, die vom Elektronenmikroskop generiert werden. Die Idee zu dieser Entwicklung hatten wir vor fünf Jahren, als wir manuell Hunderte von Schritten durchlaufen mussten, um eine 3D-Rekonstruktion eines Bakteriums zu erhalten. Konsultieren Sie im Voraus das Textprotokoll zur Vorbereitung der Shigella flexneri Minizellen.

Bereiten Sie dann die elektronenmikroskopischen Gitter vor, wie sie in einer bestehenden JoVE-Publikation erläutert und auch im Textprotokoll dokumentiert sind. Nachdem Sie den EM-Tisch mit der Ansammlung von Minizellen bestückt haben, die in verglastes Eis eingebettet sind, beginnen Sie mit dem Sammeln von Karten mit geringer Vergrößerung für die Tilt-Reihe. Wenn Sie den fluoreszierenden Bildschirm bei geringer Vergrößerung von etwa 2300x betrachten, finden Sie Rasterquadrate, die für die Abbildung akzeptabel sind.

Dieser Ort sollte dünnes Eis und das Motiv von Interesse ohne Verunreinigungen enthalten. Passen Sie als Nächstes die Ansicht an die Mitte des Rasterquadrats an und klicken Sie auf die Schaltfläche Bühnenposition hinzufügen, um die Position zu speichern. Wiederholen Sie dann den Vorgang, bis die Position aller akzeptablen Rasterquadrate gespeichert wurde.

Der nächste Schritt beginnt mit dem Öffnen einer neuen Montagedatei. Stellen Sie im Setup-Dialogfeld X und Y so ein, dass das gesamte Rasterquadrat erfasst wird. Erstellen Sie für ein Standardraster mit 200 Mesh einen Abstand von 10 x 10 mit einem hohen Binning-Wert, z. B. acht.

Schalten Sie auch die Option "Phase verschieben" anstelle von "Bild verschieben" und die Option "Korrelationen überspringen, die zum Ausrichten von Teilen verwendet werden" um. Wählen Sie nun im Navigator-Fenster die Position der ersten Stufe aus, die mit dem Umschalter "Erfassen" erfasst werden soll. Wiederholen Sie dies für jede Bühnenposition.

Klicken Sie anschließend im Menü Navigator auf Acquire at Points. Im sich öffnenden Dialogfeld schalten Sie die Option Map-Bild erfassen und grobe Euzentrizität um. Deaktivieren Sie alle anderen Optionen.

Klicken Sie dann auf Weiter, und für jede Bühnenposition wird eine Montage erstellt. Arbeiten Sie weiter mit der SerialEM-Software. Wählen Sie im Navigator die erworbenen Karten aus und klicken Sie auf Karte laden.

Klicken Sie dann auf Punkte hinzufügen und wählen Sie die Punkte auf der Karte aus, an denen die Neigungsserie erfasst werden soll. Nachdem Sie die Auswahl getroffen haben, klicken Sie auf Hinzufügen von Punkten stoppen, und wiederholen Sie den Vorgang mit jeder gesammelten Karte. Öffnen Sie als Nächstes die Parameter im Menü Kamera und stellen Sie die Modi Fokus, Versuch und Aufnahme ein.

Von besonderem Interesse kann die Option sein, dosisfraktionierte Daten aufzuzeichnen, die unter den Aufzeichnungsoptionen angegeben werden kann. Um fortzufahren, wählen Sie einen der Punkte in der aktuell angezeigten Karte aus, und schalten Sie die Option Neigungsserie im Navigator-Fenster um. Wählen Sie im sich öffnenden Dialogfeld die Parameter für die Neigungsreihe aus.

Wiederholen Sie dann den Vorgang des Umschaltens der Option "Neigungsreihe" für jeden der ausgewählten Punkte in der Karte. Starten Sie als Nächstes im Navigator die Option Erfassen an Punkten. Schalten Sie im Dialogfeld die Optionen Vorbereitende Aufgaben, Neu ausrichten auf Element, Autofokus und grobe Euzentrizität um.

Legen Sie dann für die primäre Aufgabe fest, dass Neigungsreihen erfasst werden, und wählen Sie Spaltenvariablen am Ende schließen, um die Spalte zu schließen, wenn alle Punkte erfasst wurden. Wenn der Prozess ausgeführt wird, wird an jedem Punkt, an dem die Erfassung von Neigungsserien in jeder Karte umgeschaltet wird, eine Neigungsserie erfasst. Führen Sie mit der ursprünglichen Tilt-Serie, dem Ausgabeprotokoll von SerialEM und den einzelnen dosisfraktionierten Bildern, die sich alle im aktuellen Arbeitsverzeichnis befinden, in einem Terminal den folgenden Befehl aus, um das strahlinduzierte Bewegungsartefakt zu entfernen.

Fahren Sie mit dem Ausrichten und Rekonstruieren der Kippserie fort. Geben Sie den Befehl tomoauto wie folgt in das Terminal ein. Hängen Sie an den Befehl den Dateinamen der Kippreihe an process an, gefolgt vom Passerdurchmesser in Nanometern.

Wenn die CTF-Verarbeitung nicht gewünscht ist, lassen Sie die Option einfach aus dem Befehl weg. Dieser Befehl ist die Hauptanwendung von tomoauto und ermöglicht es dem Benutzer, alle Prozesse, die mit dem Ausrichten einer Tilt-Serie verbunden sind, die ursprünglich einen manuellen Benutzereingriff erforderten, in einem einzigen Befehl auszuführen, so dass der Benutzer schnell ein Skript für die Stapelverarbeitung erstellen kann. Überprüfen Sie nun mit dem Befehl 3dmod die ausgerichtete Neigungsserie auf eklatante Fehler.

Dabei ist filename der Name der Tilt-Serie ohne Suffix. Überprüfen Sie dann die geschätzte CTF mit dem hier gezeigten Befehl. Auch hier ist filename der Name der Tilt-Serie ohne Suffix.

Überprüfen Sie außerdem im Ausgabeprotokoll, das vom Befehl tomoauto erstellt wird, den Restfehler der Ausrichtung. Dies ist ein quantitatives Maß für die Gesamtqualität der Achse. Wenn die Ausrichtung akzeptabel ist, fahren Sie mit der Berechnung der Rekonstruktion fort.

Dieser Befehl ist so eingestellt, dass die CTF korrigiert und die bei der Ausrichtung verwendeten Passermarken aus der Neigungsserie gelöscht werden. Um die Sichtprüfung zu überspringen und direkt zur Rekonstruktion zu gelangen, verwenden Sie diesen Befehl. Tomoauto bietet viele zugängliche Optionen.

Eine davon ist die Möglichkeit, lokale Konfigurationen, die durch eine Hilfsdatei beschrieben werden, gemäß der tomoauto-Dokumentation einzuschließen. Fügen Sie den Namen dieser Datei mit der lokalen Konfigurationsoption in das Befehlszeilendialogfeld ein, bevor Sie den Dateinamen der Tilt-Serie anhängen. Die Möglichkeit, lokale Konfigurationsdateien zu erstellen, ist die leistungsstärkste Funktion von tomoauto, die es den Benutzern ermöglicht, jeden verwendeten Befehl vollständig zu konfigurieren und die Ausführung auf bestimmte oder schwierige Datensätze abzustimmen, während die automatisierte Verarbeitung beibehalten wird.

Innerhalb des Testprotokolls befinden sich zusätzliche Anweisungen zur Durchführung der Sub-Tomogramm-Mittelwertbildung. In Anlehnung an die beschriebenen Protokolle wurden zwei ausgerichtete Kippserien mit tomoauto hergestellt. Die Feinausrichtung wird aus einem Modell berechnet, das im Idealfall die Passermarkenkoordinaten definiert.

Bei 50 Grad verfolgte eine Neigungsreihe die Goldpartikel korrekt, was auf eine akzeptable Ausrichtung hindeutete. Während im Fall der zweiten Neigungsserie mehrere Modellpunkte, die in Rot dargestellt sind, von der entsprechenden goldenen Markierung abwichen, ergab die Veranschaulichung des Modells keine geeignete Ausrichtung. Beim Sammeln von Neigungsserien gleicht tomoauto 80 bis 90 % der gesammelten Neigungsserien erfolgreich aus.

Nach der Rekonstruktion ist das endgültige Tomogramm ein 3D-Volumen der Bildprobe. Dies kann dann für die zelluläre Annotation durch Segmentierung oder Sub-Tomogramm-Mittelung verwendet werden, um höher aufgelöste Informationen über die molekulare Maschinerie in der Probe zu erhalten. Der Sub-Tomogramm-Durchschnitt von 2,7 Nanometern der in der EMDB hinterlegten gebundenen Shigella flexneri zeigt die große Verbesserung dieser Technik gegenüber der Betrachtung des Injektisoms in einem einzigen Tomogramm.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Kryo-Elektronentomographie-Daten mit SerialEM und tomoauto automatisiert und mit hohem Durchsatz sammeln und verarbeiten können. Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um fast 100 Neigungsserien an einem Tag zu sammeln, wenn sie richtig ausgeführt wird, und eine Neigungsserie in 20 Minuten auszurichten. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, immer daran zu denken, die Qualität der Neigungsserienausrichtung zu überprüfen.

Wenn ein Satz von Neigungsserien nicht gut ausgerichtet werden kann, versuchen Sie, manuell auszurichten, und übertragen Sie die Parameter in eine lokale Konfiguration. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Sub-Tomogramm-Mittelung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Bestimmung der höher aufgelösten Struktur von makromolekularen Komplexen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Kryo-EM, um hochauflösende In-situ-Strukturen in Bakterien, Viren und anderen Organismen zu erforschen.