Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Sca1-positive mesenchymale Stammzellen aus verschiedenen Mausfettgeweben zu isolieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass adiposengewebestammzellen aus unterschiedlichen Fettdepots mittels immunmagnetischer Säulenchromatographie effektiv angereichert werden können, um anschließende Experimente durchzuführen. In der Regel haben Forscher, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Stärke und Dauer der kollagenasevermittelten Gewebeverdauung optimiert werden muss, um eine ausreichende Anzahl an Zellen für die Sortierung zu erhalten.

Um die subkutanen Fettgewebe zu isolieren, platzieren Sie die Maus zunächst in Rückenlage auf einer Schaum-Präparationsplatte und besprühen Sie das Tier mit 70 %igem Ethanol. Nachdem Sie die Pfoten an der Platte befestigt haben, führen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut des unteren Bauchbereichs durch. Greifen Sie dann mit einer Pinzette die obere Schnittstelle und trennen Sie mit einer Schere die Haut und das Peritoneum vom Bauch bis zum Thorax ab.

Erstellen Sie seitliche Schnitte in der Haut entlang der Körperseite, und klappen Sie die Haut vom Peritoneum in Richtung Kopf zurück. Ziehen Sie dann die restliche Haut zurück, halten Sie das inguinale Fettgewebe vom Körper weg und befestigen Sie die Haut mit 22-Gauge-Nadeln am Brett. Greifen Sie anschließend mit der Pinzette einen inguinalen Fettpolster an seiner Ursprungsstelle nahe dem Peritoneum, und schneiden Sie mit feiner Schere zwischen Haut und inguinalen Fettgewebe entlang in Richtung Leiste, wobei Sie vermeiden, dass das subkutane Fettgewebe mit Haut kontaminiert wird.

Danach das isolierte Leistenfettgewebe in eine mit SQ gekennzeichnete 60-Millimeter-Schale mit Kulturmedium bei 37 Grad Celsius geben und das Leistenfettgewebe von der anderen Seite des Tieres auf die gleiche Weise entnehmen. Um die viszeralen Fettgewebe zu isolieren, wird das Peritoneum durchtrennt, um das viszerale Fettgewebe und den Darm freizulegen. Anschließend wird der Darm zur Brusthöhle hin beiseitegeschoben.

Greifen Sie das viszerale Fettgewebe am distalen Ende an, ziehen Sie vorsichtig am Fettgewebe und dissezieren Sie es aus, wobei Sie darauf achten, das Nebenhoden-Gewebe auszuschließen. Legen Sie dann das Fettgewebe in eine mit VIS beschriftete 60-Millimeter-Schale, die Kulturmedium mit 37 Grad Celsius enthält. Sobald alle Fettgewebe gesammelt wurden, bringen Sie die Schalen in eine Zellkulturhaube und aspirieren Sie das Medium.

Verwenden Sie gebogene Scheren, um die Polster zu zerkleinern. Geben Sie anschließend die Fettstücke in einzelne 50-Milliliter-Röhrchen, die frisch zubereiteten Kollagenase enthalten. Schütteln Sie die Röhrchen danach 10 bis 20 Minuten lang bei 300 U/min und 37 Grad Celsius, bis die Gewebe verdaut sind.

Einige Stücke des subkutanen Fettgewebes können noch sichtbar sein. Geben Sie 20 Milliliter Kulturmedium zur Kollagenase-Lösung hinzu, um die Verdauung zu stoppen, und aspirieren und dispensieren Sie die Gewebesuspension mithilfe einer 10-Milliliter-Serologiepipette zehnmal, um die verdauten Gewebe vollständig zu dissoziieren. Filtern Sie die Zellen durch Zellseihen mit 100 Mikrometer Porengröße und zentrifugieren Sie das Gewebe.

Danach das Medium vorsichtig abgießen, wobei darauf geachtet werden muss, die Pellets nicht aufzuwirbeln, und beide Zellgruppen vorsichtig in fünf Milliliter steriler Wasser resuspendieren. Zwei Minuten warten, bis die Erythrozyten lysiert sind. Anschließend die Reaktion in jedem Gefäß mit 25 Milliliter Medium, das mit FBS angereichert ist, stoppen.

Filtern Sie beide Adipozytenpopulationen durch neue Zellfilter mit 100 Mikron, zentrifugieren Sie erneut und resuspendieren Sie die Pellets in ein bis drei Milliliter Medium. Nach der Zellzählung mittels Trypanblau-Ausschluss werden je eine Million subkutaner Fettgewebszellen und viszeraler Zellen separat in einzelne Vertiefungen einer sechswelligen Zellkulturplatte gegeben. Nach dem Trypsinieren der Zellen verdünnen Sie das Trypsin mit einem Milliliter Separationspuffer und zentrifugieren anschließend die Kulturplatten.

Wir suspendieren die Zellen in 500 µL pro Röhrchen Separationspuffer und zentrifugieren die Zellen erneut. Nun resuspendieren wir die Zellen in 90 µL pro Röhrchen Separationspuffer und geben 10 µL anti-Sca1 FITC Primärantikörper zur Zellsuspension hinzu. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei vier Grad Celsius im Dunkeln waschen wir die Zellen mit je einem Milliliter Separationspuffer pro Röhrchen.

Nach dem Zentrifugieren werden die Zellen in 80 Mikrolitern Separationspuffer pro Zellsuspension resuspendiert. Anschließend 20 Mikroliter Anti-FITC-Mikroperlen in jedes Loch geben und die Platten 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius, vor Licht geschützt, inkubieren. Am Ende der Inkubation werden die Zellen mit einem Milliliter Separationspuffer gewaschen und pro Röhrchen in 500 Mikrolitern frischem Puffer resuspendiert.

Platzieren Sie nun eine Säule im magnetischen Halter und waschen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern Trennpuffer. Überführen Sie die Zellen aus der subkutanen Fettgewebekultur auf die Säule, wobei Sie darauf achten sollten, Luftblasen zu vermeiden, und sammeln Sie die nicht markierten Sca1-negativen Zellen in einem 15-Milliliter-Konischglas. Nachdem alle Zellen durchgelaufen sind, waschen Sie die Säule dreimal mit jeweils 500 Mikrolitern Trennpuffer.

Überführen Sie dann die Säule vom Magneten in ein neues 15-Milliliter-Konischgefäß und geben Sie ein Milliliter frischen Trennpuffer durch die Säule, um die Sca1-positiven Zellen zu eluieren. Zentrifugieren Sie abschließend sowohl die Sca1-positiven als auch die Sca1-negativen Zellfraktionen und resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter Kulturmedium. Bestimmen Sie anschließend die Anzahl der Zellen in jeder Fraktion und geben Sie die Fraktionen in einzelne Vertiefungen einer neuen sechswelligen Zellkulturplatte.

Aus subkutanem Fett isolierte vaskuläre Stromazellen weisen eine fibroblastenähnliche, gestreckte Zellform auf, unabhängig von ihrem Sca1-Expressionsniveau. Wie aus subkutanem inguinalen Fett stammende Sca1-hohe Zellen zeigen auch aus viszeralem epididymalem Fett stammende Sca1-hohe Zellen eine gestreckte, fibroblastenähnliche Zellform. Dagegen weisen VIS Sca1-niedrige Zellen eine epitheloidähnliche Form auf.

Sca1-hohe Zellen, die aus isolierten Sca1-GFP-Mäusen gewonnen wurden, lassen sich in der Gewebekultur leicht als GFP-positive Zellen identifizieren. Tatsächlich wird bei Analyse mittels Durchflusszytometrie bestätigt, dass die meisten GFP-positiven Zellen Sca1-Proteine auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, wie durch anti-Sca1-Antikörper nachgewiesen. In Kombination mit Echtzeit-PCR-Analysen kann die unterschiedliche Expression der kollagenolytischen Matrix-Metalloproteinasen zwischen aus inguinalen und epididymalen Fettgeweben stammenden Sca1-hohen, fettgewebsabgeleiteten Stammzellen gezeigt werden.

Weiterhin wird eine deutlich erhöhte Kollagen-Remodeling-Aktivität, vermittelt durch viszerale Sca1-high aus Fettgewebe stammende Stammzellen, beobachtet, wenn Fluorescein-markierte Typ-I-Kollagen-Gele zur Beurteilung der perizellulären Abbaualtivität verwendet werden. Sobald die Methode beherrscht ist, kann die Zellisolierung aus dem Fettgewebe bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, ein sauberes und geordnetes chirurgisches Feld aufrechtzuerhalten, um eine effiziente Isolierung der Fettgewebslappen sicherzustellen.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie ein Kollagenabbau-Assay durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur von fettgewebsstämmigen Stammzellen vermittelten Gewebeumgestaltung zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Adipositas- und Matrixbiologie den Weg, um die Rolle fettgewebsstämmiger Stammzellen bei der Umgestaltung und Funktion von Fettgewebe bei Mäusen und Menschen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie primäre Sca1-positive Zellen aus Fettgewebsdepots gewonnen und angereichert werden können.