Eine schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Ausbeute an Plasma-Peptidkonzentrationen im menschlichen Blut zu erhöhen

Das übergeordnete Ziel dieser RAPID-Methode ist es, die Ausbeute an endogenen Peptidhormonen, die im menschlichen Blut gemessen werden können, zu verbessern. Die RAPID-Methode wurde kürzlich für den Einsatz bei Ratten etabliert und ist auch für den Einsatz im menschlichen Blut geeignet. Die RAPID-Methode verbessert die Ausbeute und ermöglicht den Nachweis der korrekten molekularen Form des endogenen Peptids.

Die RAPID-Methode ist einfach anzuwenden. Allerdings ist die RAPID-Methode im Vergleich zur Standard-Blutentnahme zeit- und kostenintensiver. Es könnte also eher in der Forschung anwendbar sein.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die rechtzeitige Verdünnung der Proben sowie die Elution von großer Bedeutung sind, um einen korrekten Peptidspiegel zu gewährleisten. Entnehmen Sie venöses Blut zu einem standardisierten Zeitpunkt nach dem nächtlichen Fasten aus einer Unterarmvene. Und prozessieren Sie nach Standardverfahren oder der RAPID-Methode.

Weisen Sie die Probanden an, vor der Blutentnahme keinen Sport zu treiben oder zu rauchen. Für die Standardverarbeitung wird Blut in gekühlten EDTA-Röhrchen entnommen und innerhalb von 10 Minuten bei 3000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Sammeln Sie den Überstand und bewahren Sie ihn bis zur weiteren Verarbeitung durch Radioimmunoassay bei minus 80 Grad Celsius auf.

Für die RAPID-Verarbeitung das Blut sofort um eins bis 10 in eiskaltem RAPID-Puffer verdünnen. PH drei Komma sechs, enthält null Komma eins molares Amoniumasitat. Nullkomma, fünf, molares Natriumchlorid und Enzyminhibitoren.

Zentrifugieren Sie die RAPID-Probe innerhalb von 10 Minuten bei 3000 g 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand mit einer Pipette. Füllen Sie anschließend die Chromatographie-Kartuschen mit 100 % Actitoneril bei 10 Millilitern pro Minute. Nach Äquilibrierung mit 0,1 % Trifluoressigsäure oder TFA.

Befüllen Sie den RAPID-Probenüberstand mit einer konstanten Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute mit einer Spritzenpumpe. Nachdem Sie die Kartuschen mit drei Millilitern 0,1 % TFA bei 10 Millilitern pro Minute gewaschen haben, eluieren Sie die RAPID-Probe langsam mit zwei Millilitern 70 % Acetonitril mit 0,1 % TFA bei zwei Millilitern pro Minute. Trocknen Sie die eluierten Proben mit Vakuumzentrifugation und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verarbeitung durch Radioimmunoassay.

Gewinnung von Jod 125 radiomarkierten humanen Peptiden. Bewahren Sie die Peptide bis zum Experiment in Pulverform auf. Dann frisch in 0,1%Essigsäure verdünnen.

Für die Standardverarbeitung direkt nach der Blutentnahme in gekühlte EDTA-haltige Röhrchen wird ein Milliliter Blut in ein Röhrchen mit 50 Mikrolitern Radiomarkierung mit 3000 bis 6000 CPM übertragen. Für die RAPID-Verarbeitung wird ein Milliliter EDTA mit Blut in ein Röhrchen mit neun Millilitern RAPID-Puffer überführt, und 500 Mikroliter Radiomarkierung enthalten 30.000 bis 60.000 CPM. Aufgrund der Verdünnung von eins bis 10 ist ein 10-mal höheres Volumen an Radiomarkierung für die RAPID-Verarbeitung zu verwenden.

Direkt nach der Anwendung der verschiedenen Schritte der RAPID-Methode ist die Rückgewinnung von radioaktiv markierten Peptiden mit Hilfe eines Gamma-Zählers zu beurteilen. Trocknen Sie die Proben nicht durch Vakuumzentrifugation und beachten Sie, dass sie bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Zur Messung wird der Überstand in Röhrchen überführt, die in den Gamma-Zähler passen.

Und bewerten Sie die Zählungen pro Minute. Messen Sie den gesamten Überstand in Standardproben. Bei RAPID-Proben wird ein Zehntel des Gesamtvolumens analysiert, um eine vergleichbare Menge an radioaktiver Markierung zu erreichen.

Verwenden Sie als 100%-Standard zwei Proben mit 50 Mikrolitern enzymmarkiertem Jod-125-Peptid, die nicht verarbeitet werden. Messen Sie die Radioaktivität aller Proben gleichzeitig. Entnehmen Sie Blut in gekühlten EDTA-haltigen Röhrchen und überführen Sie einen Milliliter in Röhrchen mit 200 Mikrolitern radioaktiv markiertem Acylghrelin mit 15.000 bis 20.000 CPM für die Standardverarbeitung.

Für die RAPID-Verarbeitung wird ein Milliliter Blut in ein Röhrchen mit neun Millilitern Rapid Buffer und 200 Mikrolitern radioaktiv markiertem Acylghrelin mit 15.000 bis 20.000 CPM überführt. Verarbeiten Sie anschließend die Proben wie zuvor. Für die weitere Analyse mittels Umkehrphasen-HPLC laden Sie die Proben direkt auf eine C18-Säule mit stabiler Bindung, die in 17 % Acetonitril in Wasser mit 0,1 % TFA äquilibriert ist.

Nach fünf Minuten Äquilibrierung verwenden Sie einen Gradienten von 17 bis 40 % Acetonitril, um die Probe in 40 Minuten mit einem Milliliter pro Minute zu eluieren. Sammeln Sie jede Minute Bruchteile von einem Milliliter und analysieren Sie die Radioaktivität mit einem Gamma-Zähler. In einem separaten Experiment werden 200 Mikroliter radioaktiv markiertes Acylghrelin mit einem Gehalt von 15.000 bis 20.000 CPM direkt auf die Säule geladen und die HPLC wie zuvor durchgeführt.

Für den Radioimmunoassay sind gefrorene Überstände und vakuumgetrocknetes Pulver bei Raumtemperatur aufzutauen. Unmittelbar vor dem Radioimmunoassay sind trockene RAPID-Proben in doppelt destilliertem Wasser entsprechend dem ursprünglichen Plasmavolumen erneut zu suspendieren. Beurteilen Sie Kisspeptin und Gesamt-Ghrelin sowie Acyl-Ghrelin mit kommerziellen Radioimunoassays gemäß den Protokollen des Herstellers.

Verwenden Sie Borosilikatrohre, die eine stabile Palettenbildung ermöglichen. Am ersten Tag werden die Proben mit dem Assay-Puffer und dem primären Atibody in der vom Hersteller bereitgestellten Verdünnung für einen Zeitraum von 24 Stunden inkubiert. Am zweiten Tag fügen Sie den Jod-125-Tracer hinzu, wirbeln Sie vor und inkubieren Sie für einen Zeitraum von 24 Stunden.

Am dritten Tag das Fällungsreagenz hinzufügen, vortexen und inkubieren, wie vom Hersteller empfohlen. Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 3.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie die Überstände und zählen Sie die Radioaktivität in den Paletten mit einem Gamma-Zähler

Berechnen Sie das Desacylghrelin als Differenz aus dem Gesamtghrelin minus dem Acylghrelin. Bewertet das Verhältnis von Acyl, Desacyl-Ghrelin, indem Acyl durch Desacyl-Ghrelin für jede einzelne Probe getaucht wird. Wenn möglich, verarbeiten Sie alle Proben in einer Charge, um Schwankungen zwischen den Assays zu vermeiden.

Die RAPID-Blutaufbereitung erhöht die Ausbeute an radioaktiv markierten Jod-125-Peptiden im menschlichen Blut im Vergleich zur Standardblutverarbeitung. Nach der Standard-Blutaufbereitung lag die Rückgewinnung von radioaktiv markierten Peptiden zwischen 48 % und 68 % in neun Peptiden. Die RAPID-Verarbeitung verbesserte die Ausbeute in allen Jod-125-markierten Peptiden mit einer Wiederfindung zwischen 71 % und 98 %. Hier ist das Elutionsprofil von Jod-125-markiertem Acylghrelin im menschlichen Blut nach Standard- oder RAPID-Blutverarbeitung dargestellt.

Nach der RAPID-Verarbeitung entzog sich Jod-125-markiertes Ghrelin an der erwarteten Position. Nach dem Standardverfahren wurde ein früherer Peak beobachtet. Entspricht wahrscheinlich Desacylghrelin.

Dies entsprach einem Abbau des Peptids um 62%. Die RAPID-Blutaufbereitung verbessert das Verhältnis von Acyl und Desacylghrelin im Vergleich zur Standardverarbeitung. Nach der RAPID-Verarbeitung betrug das Verhältnis von Acyl und Desacylghrelin im Blut normalgewichtiger Probanden eins zu drei.

Im Vergleich zu einer bis 23 nach der Standardblutverarbeitung. Ähnliche Ergebnisse wurden unter magersüchtigen und adipösen Bedingungen beobachtet. Die RAPID-Blutaufbereitung führt zu erhöhten endogenen Kisspeptin-Blutspiegeln im Vergleich zur Standardverarbeitung.

Sowohl bei magersüchtigen als auch bei normalgewichtigen Probanden waren die zirkulierenden endogenen Kisspeptinspiegel nach RAPID im Vergleich zur Standardverarbeitung signifikant höher. Unter Bedingungen der Adipositas erreichte der Unterschied keine signifikante Bedeutung. Einmal gemeistert und richtig ausgeführt, kann diese Technik in weniger als einer Stunde durchgeführt werden.

Diese Methode ist besonders wichtig, wenn die erwartete Konzentration des Peptids niedrig ist oder die Unterschiede zwischen den Gruppen gering sind. Eine generelle Empfehlung für Peptide kann nicht gegeben werden. Der potenzielle Nutzen für jedes Peptid sollte zu Beginn einmal getestet werden.

Diese Technik ebnet Forschern in verschiedenen Bereichen den Weg, um die Ausbeute und vor allem die korrekte molekulare Form endogener Peptidhormone zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die RAPID-Methode für die Blutverarbeitung beim Menschen anwenden können.