Kutane Surgical Denervation: eine Methode zur Prüfung der Voraussetzung für die Nerven in Maus-Modellen der Haut-Krankheit

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Einfluss von Nerven auf normale und pathologische Haut zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen in der Biologie der normalen Haut zu beantworten, beispielsweise, ob kutane Nerven die Homöostase und Krankheiten beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass intakte und denervierte Hautproben desselben Tieres miteinander verglichen werden können.

Die visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend, da Nerven schwer zu erkennen und mit minimalem Schaden für das umliegende Gewebe zu entfernen sind. Zuerst betäuben Sie die Maus und überprüfen, ob die richtige Sedierungstiefe durch einen Zehenquetschtest erreicht wurde. Bestätigen Sie außerdem, dass die Maus eine normale Atmung und einen regelmäßigen Herzschlag aufweist.

Legen Sie das Tier nun auf eine Wärmematte in einen aseptischen Operationsbereich. Entfernen Sie mit einem elektrischen Schermesser vorsichtig das Haar an der dorsalen Seite, an der die Biopsie entnommen wird. Wischen Sie anschließend die rasierte Fläche mit Betadine- und Alkoholtüchern ab.

Stellen Sie sicher, dass alle Haarabschnitte von der Stelle entfernt wurden. Umreißen Sie nun die Biopsiestelle mit einem schwarzen Stift. Um Längsschnitte der Haarfollikel zu erhalten, sollte die längere Kante der Biopsie in anteriore-posteriore Richtung paraszepital zur dorsalen Mittellinie verlaufen.

Erstellen Sie mit einem Skalpell einen vollständigen Exzisionschnitt, ohne die darunterliegende Muskeleinfassung zu beschädigen. Blutungen sind in der Regel minimal. Die Biopsieprobe sollte Epidermis, Dermis, subkutanes Fettgewebe und Panniculus carnosus umfassen.

Das ausgeschnittene Hautprobenstück mit der Dermisseite nach unten auf ein trockenes Papiertuch legen. Überschüssiges Papiertuch abschneiden und die Probe gegebenenfalls bis zu einer Stunde lang auf kaltem TBS aufbewahren, wenn noch weitere Proben gesammelt werden müssen. Zurück beim Mäuschen: Die Biopsiestelle mit 60 Nylon-Nähten, die etwa drei Millimeter voneinander entfernt liegen, vernähen.

Überwachen Sie anschließend die Maus in einem Erholungskäfig, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt. Verwenden Sie Analgetika gemäß den vorgeschriebenen Richtlinien der institutionellen Tierversorgung und befolgen Sie deren Vorgaben, falls die Maus gestresst erscheint. Entfernen Sie die Nähte innerhalb von sieben bis zehn Tagen nach der Operation.

Fahren Sie mit der Aufarbeitung der Biopsien für die Histologie oder die Ganzpräparat-Färbung fort. Betäuben Sie das Tier, rasieren Sie die gesamte dorsale Haut ab und reinigen Sie die Region analog zum Biopsieverfahren. Führen Sie nun mit einem sterilen Skalpell einen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie von der Halsbasis bis etwa einen halben Zentimeter über dem Schwanzansatz durch.

Unter Verwendung steriler stumpfer Pinzette die Haut an der linken Seite vorsichtig vom Flankengewebe wegziehen, um das darunterliegende Gewebe vom Schulterfettgewebe in Halsnähe bis knapp oberhalb der Hinterextremität sichtbar zu machen. Identifizieren Sie nun unter dem Stereomikroskop den dorsalen kutanen Nerv. Diese erscheinen als weiße Stränge, die kaudal durch die durchscheinende Faszie der Körperwand verlaufen, bevor sie scharfe Biegungen machen und in das lockere Bindegewebe unter der Haut eintreten.

Als Nächstes entfernen Sie mit feinsten Pinzetten exklusiv die Nerven der linken Körperseite des Tieres, die sich an den anatomischen Stellen T3 bis T12 befinden, indem Sie sie von der Stelle, an der ihre Segmente an der Körperwand abknicken, bis zu ihren Eintrittsstellen in die Haut abziehen. Halten Sie die Pinzette vertikal ausgerichtet und greifen Sie die Nerven etwa einen halben Zentimeter unterhalb ihrer Knickstellen. Sobald sie erfasst sind, ziehen Sie nach oben, um die Nerven zu dehnen und von dem umgebenden Gewebe zu lösen, um sie anschließend zu entfernen.

Vermeiden Sie eine Beschädigung der benachbarten Blutgefäße. Achten Sie darauf, das Gewebe während des gesamten Verfahrens feucht zu halten, indem Sie in regelmäßigen Abständen Tropfen einer 0,9 %igen Kochsalzlösung hinzufügen. Entfernen Sie weiterhin alle Nerven, die sich von der Körperwand zum Hautgewebe ziehen, verletzen Sie jedoch nicht die Nerven innerhalb der dichten Faszie der Körperwand.

Entfernen Sie anschließend sämtliche Nerven aus dem freigelegten Hautlappen. Diese Fasern bestehen aus den distalen Ästen des dorsalen kutanen Nervs und erscheinen als weiße, verzweigte Stränge, die unregelmäßig im Bindegewebe auf der dermalen Seite des Hautlappens liegen. Um diese feinen Äste zu entfernen, positionieren Sie die Pinzette annähernd parallel zur dermalen Oberfläche, greifen Sie den Nerv an und ziehen Sie nach oben.

Entfernen Sie auf diese Weise alle sichtbaren Nerven. Verletzen Sie dabei weder die Blutgefäße noch die Haut. In diesem Schritt ist es wichtig, das Platzen benachbarter Blutgefäße zu vermeiden.

Wenn Sie einen Nerv mit einem angrenzenden Blutgefäß finden, verfolgen Sie ihn schließlich zu einer Stelle, an der kein angrenzendes Gefäß vorhanden ist, und entfernen Sie ihn durch Herausziehen. Lockern Sie nun die Haut auf der rechten Seite des dorsalen Mittellinien-Schnitts, entfernen Sie jedoch keine Nerven. Dies dient als kontralaterale placebochirurgische Kontrolle.

Schließen Sie schließlich das Tier chirurgisch und überwachen Sie es wie zuvor postoperativ. Um später den dauerhaften Ausfall der Nervenfunktion zu bestätigen, pieksen Sie Wochen nach der Operation den denervierten Bereich vorsichtig mit einer sterilen Hohlnadel. Achten Sie darauf, ob das Tier reagiert, typischerweise durch Schaudern oder Drehen des Kopfes.

Wenn der Hautbereich stabil denerviert wurde, zeigt das Tier kaum oder keine Reaktion. Entnehmen Sie Hautbiopsien aus dem Bereich ohne Reaktion und der kontralateralen Schein-Seite, um paarierte experimentelle und Kontrollproben zu erhalten. Aus den Biopsien ist es wichtig, mehrere histologische Schnitte zu untersuchen, um mögliche Unterschiede in der Häufigkeit oder Morphologie von Tastkuppen zwischen den Schein- und den denervierten Proben zu identifizieren.

Der glebe one cree ERT2-Mausstamm ermöglicht es, die durch Tamoxifen induzierte genetische Rekombination auf Hautareale zu beschränken, die eine hohe Hedgehog-Signalwegaktivität aufweisen, wie beispielsweise die Berührungskuppen-Epithelien. Diese Mäuse wurden mit abolaxi-Reportermäusen gekreuzt, um die Berührungskuppen-Epithelien sichtbar zu machen. Knoten sind entscheidend für die Aufrechterhaltung sowohl normaler Berührungskuppen als auch der damit assoziierten Merkel-Zellen.

Dies wird experimentell durch den schrittweisen Verlust der normalen Morphologie der Tastkuppe sowie durch den Verlust von Keratin-acht-exprimierenden Zellen nach Denervierung belegt. Nerven sind außerdem entscheidend, um die Hedgehog-Signalübertragung in der Tastkuppe zu fördern, wie durch die Expression von Glebe-one-cree-ERE2 und durch kollektive Beta-Seitenfärbungen in Hautproben sowohl von Scheinkontrollen als auch von denervierten Tieren nachgewiesen wurde. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dorsale kutane Nerven chirurgisch ablatiert, um zu testen, ob diese Nerven an der normalen Hautfunktion beteiligt sind oder ob sie Krankheiten modulieren.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie routinemäßig und zuverlässig mit minimalem Stress für das Tier durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren können Methoden wie die amino-fluoreszierende Färbung verwendet werden, um zu überprüfen, ob die Nerven vollständig aus der Haut ablatiert wurden und ob die Genexpression beeinflusst wird.