Erkennen Cortex Fragmente während der bakteriellen Sporenauskeimung

Das übergeordnete Ziel dieses Schritt-für-Schritt-Protokolls ist es, die Häufigkeit von Kortexfragmenten oder reduzierenden Zuckern während der Keimung von Bakteriensporen zu quantifizieren. Diese Methode beschreibt die Schritte, die erforderlich sind, um das Vorhandensein von Kortexfragmenten oder reduzierenden Zuckern während der Sporenkeimung nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die meisten Laboratorien über die Reagenzien und Geräte verfügen, die für den erfolgreichen Abschluss des Protokolls erforderlich sind.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie ein Röhrchen mit Clostridium difficile-Sporen in einen Heizblock legen und ihn 30 Minuten lang bei 65 Grad Celsius inkubieren. Stellen Sie das Röhrchen nach der Inkubation auf Eis. Die Keimlösung ist spezifisch für die untersuchte Bakteriensporenart.

Für die Bestimmung der Keimung von C.difficile-Sporen verwenden wir eine Lösung von 10 millimolaren Tris bei einem pH-Wert von 7,5 mit 150 millimolar Natriumchlorid, 100 millimolarem Glycin und 10 millimolarer Taurocholsäure in deionisiertem Wasser. Bereiten Sie einen Milliliter Keimlösung pro Probe plus einen weiteren Milliliter vor. Bevor Sie mit dem Assay beginnen, geben Sie einen Milliliter der Keimlösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie es beiseite.

Dieser dient als Rohling für die Erkennung von Cortex-Fragmenten. Als nächstes geben Sie zur Keimlösung Sporen zu einem OD600 von etwa 3,0 und wirbeln Sie sie kurz ein. Diese Menge an Sporen eignet sich gut, um die Freisetzung von Rindenfragmenten während der Keimung von C.difficile-Sporen zu moderieren.

Unmittelbar nach der Zugabe der Sporen wird eine 1,2 Milliliter große Probe in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen entnehmen und in die Zentrifuge gegeben. Zentrifugieren Sie dann eine Minute lang bei Raumtemperatur bei 14.000 μm G. Dies ist der Nullpunkt. Nach dem Schleudern einen Milliliter des Überstands in ein frisches Zwei-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen umfüllen und bei minus 80 Grad Celsius einfrieren.

Wiederholen Sie den Vorgang der Aliquotentnahme, des Schleuderns und Einfrierens in regelmäßigen Abständen, bis die Probe für jeden Zeitpunkt entnommen wurde. Aufgrund des Zeitaufwands für die Zentrifugation und Probenahme sind bei diesem Verfahren keine Zeitpunkte von weniger als zwei Minuten möglich, daher werden diese Proben alle zwei Minuten für 14 Minuten entnommen. Falls bei der Vorbereitung der Cortex-Proben Dipicolinsäure überwacht werden muss, entnehmen Sie eine separate 100-Mikroliter-Probe und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.

Bereiten Sie auch Proben für die Erstellung einer Standardkurve mit den folgenden Mengen an N-Acetylglucosamin vor. Null, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 und 5.000 Nanomol in Keimlösung. Nachdem für jeden Zeitpunkt eine Probe entnommen wurde, nehmen Sie die Proben aus dem Gefrierschrank und lyophilisieren Sie sie zusammen mit der Blindprobe und der Standardkurvenprobe.

Lagern Sie dann alle Proben bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Am Tag des Assays werden die lyophilisierten Proben, einschließlich der Kontroll- und Standardkurvenproben, in 120 Mikrolitern Salzsäure mit Phenol und Beta-Mercaptoethanol resuspendiert. Übertragen Sie als Nächstes alle resuspendierten Proben in frische Zwei-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen.

Dann inkubieren Sie sie vier Stunden lang in einem Umlaufwasserbad bei 95 Grad Celsius. Legen Sie die Proben nach der Inkubation auf Eis, bis sie abgekühlt sind. Fügen Sie dann 120 Mikroliter dreimolares Natriumhydroxid hinzu, um sie zu neutralisieren.

Geben Sie anschließend 80 Mikroliter einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung und 80 Mikroliter einer 5%igen Essigsäureanhydridlösung in jede Probe und wirbeln Sie sie ein. Anschließend inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation werden die Proben für genau drei Minuten wieder in das 95 Grad Celsius heiße Wasserbad überführt.

Beachten Sie, dass dieser Schritt zeitkritisch ist und längere Zeiten die nachgelagerte Signalentwicklung beeinflussen können. Nehmen Sie die Proben aus dem Wasserbad und kühlen Sie sie auf Eis ab. Geben Sie 400 Mikroliter 6,54%iges Kaliumtetraborat-Tetrahydrat in jedes Röhrchen und jeden Vortex.

Inkubieren Sie die Proben in einem Umlaufwasserbad bei 95 Grad Celsius für genau sieben Minuten. Dieser Schritt ist auch zeitkritisch. Entnehmen Sie die Proben und legen Sie sie fünf Minuten lang auf Eis.

Während die Proben auf Eis liegen, bereiten Sie das Farbreagenz vor. Lösen Sie 0,320 Gramm DMAB in 1,9 Millilitern Eisessig. Beachten Sie, dass dieses Reagenz zeit-, temperatur- und lichtempfindlich ist und nicht im Voraus hergestellt werden sollte.

Nachdem sich das DMAB vollständig aufgelöst hat, fügen Sie 100 Mikroliter 10 normale Salzsäure hinzu und wirbeln Sie die Probe ein. Dann fünf Milliliter Eisessig zugeben und erneut vortexen. Für die kolorimetrische Reaktion werden 100 Mikroliter jeder gekühlten Rinde oder Kontrollprobe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.

Geben Sie 700 Mikroliter der frisch zubereiteten Farblösung zu jeder Probe. Übertragen Sie die Proben sofort in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad und inkubieren Sie die Proben genau 20 Minuten lang. Nach der Inkubation werden 200 Mikroliter jeder Probe auf eine durchsichtige 96-Well-Platte umgefüllt.

Die Proben sollten zunächst gelb gefärbt sein, wechseln aber zu violett, wenn reduzierender Zucker vorhanden ist, der auf das Vorhandensein von Kortex hinweist. Hier zeigen viele der Proben keine sichtbare violette Farbe. Die 250-, 500- und 5.000-Nanomol-Proben unterscheiden sich jedoch optisch von der negativen Null-Nanomol-Kontrolle.

Bestimmen Sie mit einem Plattenleser die Absorption bei 585 Nanometern. Bei der Messung in einem Außendurchmesser von 585 Nanometern passt das aus den Standardproben erzeugte Signal am besten zu einer linearen Regression. Diese Tabelle zeigt typische Ergebnisse unter Verwendung von N-Acetylglucosamin-Standards.

Aus diesen Daten wurde dann die hier gezeigte Normkurve generiert. Ein Keimungsassay wurde unter keimfördernden Bedingungen mit Keimpuffer durchgeführt, der mit 100 millimolarem Glycin und 10 millimolarer Taurocholsäure ergänzt wurde. Unter nicht keimenden Bedingungen nur 100 Millimolar Glycin.

In Abwesenheit von Taurocholsäure keimen C.Difficile-Sporen nicht, und das Vorhandensein von Kortexfragmenten in der Lösung ändert sich kaum. In Gegenwart von Taurocholsäure und Glycin keimen jedoch C.difficile-Sporen und geben Rindenfragmente an die Lösung ab. Dies wird als Anstieg des OD585 über die Zeit der umgesetzten Proben absorbiert.

Die Menge der während dieses Assays freigesetzten Cortex-Fragmente wurde anhand einer Standardkurve berechnet. Wie hier in diesem Assay zu sehen ist, wurde der größte Teil der Hirnrinde 15 Minuten nach der Keimexposition hydrolysiert oder freigesetzt. Dies deutet darauf hin, dass die meisten Sporen in diesem Zeitraum gekeimt sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kortexfragmente oder reduzierende Zucker in einer Keimlösung während der Keimung von Bakteriensporen erkennt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, genau auf die Reaktionszeiten zu achten, damit sich der Assay korrekt entwickelt.