Hochdurchsatz-Gene Tagging in
12. August 2016
Das Hinzufügen eines Tags zu einem Protein ist eine mächtige Möglichkeit, Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Hunderte von Trypanosoma brucei-Proteinen parallel endogen zu markieren, so dass eine Markierung im Genommaßstab möglich ist.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Proteine in Trypansoma brucei hochdurchsatzfähig zu markieren. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Kinetoplastida bezüglich der Lokalisation und potenziellen Funktion großer Protein-Kohorten zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass große Mengen an Proteinen parallel schnell und einfach markiert werden können.
Obwohl diese Methode Einblicke in die Lokalisation ermöglicht, können auch Wechselwirkungen großer Protein-Kohorten mithilfe anderer Tags untersucht werden. Zum Beispiel das BirA-Tag für ein Bio-ID-Näherungskartierungsexperiment. Den Ablauf wird Ross Madden, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus unserem Labor, demonstrieren.
Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, kühlen Sie einen 96-Loch-PCR-Kühler im Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank vor. Bereiten Sie den Master-Mix A vor, indem Sie die folgenden Komponenten in einem 10-Milliliter-Röhrchen kombinieren: 2, 100 Mikroliter destilliertes, deionisiertes Wasser, 105 Mikroliter PCR-gradigen DMSO, 105 Mikroliter 10-Millimolar-dNTPs und 105 Mikroliter pPOT-Vorlage.
Geben Sie Master-Mix A in ein Reagenzienreservoir und portionieren Sie 23 Mikroliter von Master-Mix A in jede Vertiefung einer 96-Loch-PCR-Platte. Fügen Sie mit einer P20 12-Kanal-Mehrkanalpipette zwei Mikroliter eines 100 Mikromolar-Pool-Primers zu jeder beladenen Vertiefung hinzu. Versiegeln Sie die Platte mit einer Folie.
Platzieren Sie es auf den vorgekühlten PCR-Kühler und lassen Sie es mindestens 20 Minuten bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Das Einfrieren der PCR-Master-Mix-A ist entscheidend, um eine effiziente Hot-Start-Reaktion sicherzustellen, auch bei Verwendung einer spezifischen Hot-Start-Polymerase. Dies führt zu einer reproduzierbaren und ertragreichen Amplifikation.
Während sich die PCR-Platte im Gefrierschrank befindet, bereiten Sie Master-Mix B vor. Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in einem 10-Milliliter-Röhrchen: 2.048 Mikroliter destilliertes, deionisiertes Wasser, 525 Mikroliter 10X-Puffer und 52,5 Mikroliter Polymerase, insgesamt 2.626 Mikroliter pro Platte. Entnehmen Sie die PCR-Platte und den PCR-Kühler aus dem Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank.
Während sich die Platte noch auf dem PCR-Kühler befindet, sofort 25 µL der Master-Mix-B-Lösung auf den gefrorenen Master Mix A in jedes Well pipettieren, sodass sich ein Gesamtvolumen von 50 µL pro Ansatz ergibt. Dieser Schritt ist zeitempfindlich und muss abgeschlossen sein, bevor sich Master Mix A auftauen kann. Die Platte mit einer Folie versiegeln.
Stellen Sie den Thermocycler wie folgt ein: 94 °C für 10 Minuten, dann 30 Zyklen mit 94 °C für 15 Sekunden, 65 °C für 30 Sekunden und 72 °C für zwei Minuten, gefolgt von einer abschließenden Verlängerungsphase von 72 °C für sieben Minuten. Sobald der Block 94 °C erreicht hat, laden Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und starten das Amplifikationsprogramm.
Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung eines großen 1 %igen Agarosegels im Tris-Acetat-EDTA- oder TAE-Laufpuffer mit vier Reihen von Vertiefungen. Geben Sie eine 1-kb-DNA-Leiter in die erste und 28. Vertiefung jeder Reihe. Als nächster Schritt wird 2 µL PCR-Produkt direkt, ohne DNA-Ladepuffer, in jede Gelelektrophorese-Spur gemäß dem hier gezeigten Muster überführt.
Beispielsweise werden die PCR-Produkte aus den Reihen A und B der PCR-Platte jeweils in die ungeraden und geraden Gellöcher der ersten Gelreihe geladen. Um die Gefahr einer Kontamination der Amplikone zu verringern, werden die PCR-Produkte aus Reihe A der PCR-Platte schnell in die ungeraden Gellöcher der ersten Gelreihe pipettiert. Anschließend werden die PCR-Produkte aus Reihe B der PCR-Platte in die geraden Gellöcher der ersten Gelreihe geladen.
Laden Sie die PCR-Produkte aus den Reihen C und D der PCR-Platte in diesem gleichen Muster auf, wobei Reihe C in die ungeradzahligen Gelen und Reihe D in die geradzahligen Gelen der zweiten Reihe des Gels pipettiert wird. Setzen Sie dieses Belademuster fort, bis jede Vertiefung der PCR-Platte auf das Gel aufgetragen wurde. Platzieren Sie das Gel in den Elektrophoresekammer und füllen Sie die Kammer mit TAE-Laufpuffer, bis das Gel vollständig bedeckt ist.
30 Minuten bei 100 Volt laufen lassen. Mit einem UV-Durchlichttisch sichtbar machen. Gezeigt ist ein repräsentativer Agarosegel für die PCR-Validierung in einer 96-Loch-Platte, bei dem 95 von 96 PCR-Reaktionen erfolgreich waren.
Die erfolglose PCR war H11. Dieses Verfahren verwendet Trypanosoma brucei, procyclische Form, Zelllinie SMOXP9. Kultivieren Sie die Zellen bis zur geeigneten Dichte, wie im Protokolltext beschrieben, und gewinnen Sie die erforderliche Anzahl an Zellen durch Zentrifugation bei 800 × g für 10 Minuten.
Beginnen Sie mit den Vorbereitungen für die Elektroporation, während die Zellen zentrifugiert werden. Schließen Sie den Plattenhandler an das Elektroporationsgerät an. Stellen Sie am Elektroporationsgerät die Spannung auf 1.500 Volt, die Pulslänge auf 100 Mikrosekunden, die Anzahl der Pulse auf 12 und das Pulsintervall auf 500 Millisekunden ein.
Stellen Sie am Plattenwechsler die Impulsanzahl auf eins ein. Übertragen Sie mit einer 12-Kanal-Mehrfachpipette (P200) die PCR-Reaktionen von der PCR-Platte in eine 96-Well-Disposable-Elektroporationsplatte. Waschen Sie die Zellen in 10 Milliliter modifiziertem Cytomix und zentrifugieren Sie erneut bei 800 × g für 10 Minuten.
Resuspendieren Sie die Zellen in 23 Milliliter modifiziertem Cytomix, um eine Endkonzentration von fünf mal 10 hoch 7 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Überführen Sie die Zellsuspension in ein Reagenzienreservoir. Pipettieren Sie 200 Mikroliter der Zelllösung in jedes Loch der Elektroporationsplatte und mischen Sie mit dem PCR-Produkt durch Pipettieren.
Entfernen Sie mit einem Tuch eventuelle Tropfen von der Oberseite der Platte, um Kurzschlüsse zu vermeiden. Bringen Sie eine Versiegelungsfolie auf der Oberseite der Elektroporationsplatte an, und positionieren Sie sie so, dass die Löcher für die Elektroden an der Ober- und Unterseite jeder Spalte frei bleiben. Vermeiden Sie es, die Erhebungen abzudecken, die zum Ausrichten der Folie dienen.
Laden Sie die Elektroporationsplatte in den Plattenhandler ein und schließen Sie die Abdeckung. Drücken Sie „Puls“ am Elektroporationsgerät. Nach der Elektroporation müssen die Zellen schnell auf vier 24-Loch-Zellkulturplatten übertragen werden, die je ein Milliliter SDM-79-Medium pro Loch zur Erholung enthalten.
Verwenden Sie eine P200 12-Kanal-Mehrfachpipette, bei der jede zweite Pipettierspitze fehlt, sodass die verbleibenden sechs Spitzen mit den sechs Reihen einer 24-Loch-Zellkulturplatte übereinstimmen. Nachdem die Zellen von der 96-Loch-Platte in die 24-Loch-Platte übertragen wurden, spülen Sie die Vertiefungen der 96-Loch-Platte mit Medium aus den entsprechenden Vertiefungen der 24-Loch-Platte. Übertragen Sie dann den Spülansatz zurück in die Vertiefungen der 24-Loch-Platte.
Übertragen Sie die elektroporierten Zellen von der 96-Loch-Elektroporationsplatte auf die 24-Loch-Zellkulturplatten nach dem hier gezeigten vordefinierten Muster. Beispielsweise werden Zellen aus den ungeradzahligen Vertiefungen von Reihe A der 96-Loch-Platte in Reihe A von Platte A übertragen, während Zellen aus den geradzahligen Vertiefungen von Reihe A der 96-Loch-Platte in Reihe A von Platte C übertragen werden. Nach jeder Übertragung der Zellen von der 96-Loch-Platte auf die 24-Loch-Platte spülen Sie die Vertiefungen der 96-Loch-Platte mit Medium aus der entsprechenden Reihe der 24-Loch-Platte aus. Anschließend übertragen Sie die Spülflüssigkeit zurück auf die 24-Loch-Platte.
Das Übertragen der Zellen in die 24-Loch-Platten ist verwirrend, aber Sie müssen in der Lage sein, die resultierenden Zelllinien der korrekten Gen-ID zuzuordnen. Es ist entscheidend, diesen Schritt schnell durchzuführen, um die Zellen gesund zu halten. Nachdem alle elektroporierten Zellen auf die vier 24-Loch-Platten übertragen wurden, stellen Sie die 24-Loch-Platten in eine saubere Kunststoffbox mit einem dicht abschließenden Deckel. Stellen Sie die Box in einen Inkubator bei 28 Grad Celsius.
Sechs bis acht Stunden später je ein Milliliter SDM-79 mit 10 % FCS, das das selektive Antibiotikum enthält, in jede Vertiefung geben. Bei 28 Grad Celsius für neun bis zehn Tage inkubieren, bis transgene Zelllinien sichtbar werden. Nach einer 96-Loch-Transfektion zur Markierung von 96 verschiedenen Proteinen am Endterminus werden die Zellen zur Erholung und Selektion in 24-Loch-Gewebekulturplatten überführt.
Jedes Well wird anschließend daraufhin überprüft, ob es gesunde, arzneimittelresistente Zellen enthält. Ein gesundes Well enthält überwiegend hochaktive Zellen, die in der Phasenkontrastmikroskopie hell erscheinen. In diesem schematischen Beispiel steht grün für ein Well mit erfolgreicher Transfektion und grau für ein Well, das nur tote Zellen enthält.
88 von 96, also 92 % der Vertiefungen, enthalten nach 15 Tagen Selektion erfolgreich transfizierte Parasiten. Wenn man den Vorgang einmal beherrscht, dauert es ungefähr eine Stunde, von der Zählung der Zellen bis zur Ausplattierung nach der Elektroporation. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die selektiven Wirkstoffe sechs bis acht Stunden nach der Transfektion hinzuzufügen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man große Protein-Kohorten in Trypansoma brucei markiert.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Hochdurchsatzmethode zur Markierung von Proteinen in Trypanosoma brucei vor, die die Untersuchung der Proteinlokalisation und -funktion ermöglicht. Das Protokoll erlaubt die parallele Markierung von Hunderten von Proteinen und erleichtert damit genomweite Studien im großen Maßstab.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Genomik
Hintergrund
- Die Proteintaggung ist entscheidend, um die Proteinfunktion zu verstehen.
- Trypanosoma brucei ist ein Modellorganismus zur Untersuchung von Kinetoplastiden.
- Hochdurchsatztechniken erhöhen die Effizienz von Proteinanalysen.
- Mithilfe des Taggens können Lokalisation und Interaktionsdynamik von Proteinen aufgeklärt werden.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur endogenen Markierung von Proteinen in T. brucei.
- Erleichterung der Untersuchung der Proteinlokalisation und -funktion.
- Möglichmachung der genomweiten Markierung im großen Maßstab für umfassende Studien.
Verwendete Methoden
- Herstellung von PCR-Master-Mixes zur Amplifikation.
- Elektroporation von T. brucei-Zellen mit markierten Konstrukten.
- Validierung von PCR-Produkten mittels Agarose-Gelelektrophorese.
- Verwendung spezifischer Tags für Proteininteraktionsstudien.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Markierung einer großen Kohorte von T. brucei-Proteinen.
- Hohe Ausbeute und Reproduzierbarkeit der PCR-Amplifikation.
- Nachgewiesene Durchführbarkeit von Hochdurchsatz-Proteinstudien.
- Validierung der Methode durch erfolgreiche PCR-Ergebnisse.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll ermöglicht eine effiziente Proteintaggung in T. brucei.
- Diese Methode kann die Forschung im Bereich der Kinetoplastida erheblich voranbringen.
- Zukünftige Studien können diese Technik nutzen, um tiefere Einblicke in Proteinfunktionen zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Mithilfe der Hochdurchsatz-Proteinmarkierung lassen sich systematische funktionelle Annotationen von Pathogen-Proteomen durchführen und die Entschärfung von Zielstrukturen in der frühen Phase der antiparasitären Wirkstoffforschung unterstützen. Durch die Erstellung markierter Bibliotheken aus endogenen Loci liefert diese Methode quantitative Daten zur Lokalisation und zu Wechselwirkungen, die für die Priorisierung pharmakologisch angreifbarer Zielstrukturen in der Forschung zu vernachlässigten Krankheiten unerlässlich sind. Die Skalierbarkeit des Ansatzes entspricht genomweiten Screening-Initiativen und beschleunigt die Zyklen von der Hypothesenbildung bis zur Validierung in Workflows zur Zielstrukturvalidierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch endogene Markierung von Pathogenproteinen zur Bestimmung ihrer Lokalisation und Wechselwirkungsnetzwerke.
- Operativer Wert: Erlaubt die parallele Markierung von Dutzenden bis Hunderten von Kandidaten und erhöht somit den Durchsatz bei der Zielkandidatenauswahl und der nachfolgenden phänotypischen Bildschirmung.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem reproduzierbare Daten zur subzellulären Lokalisation und zur Ko-Immunpräzipitation über große Genkohorten hinweg generiert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt validierte Zelllinien, die markierte Proteine exprimieren, und ermöglicht standardisierte Assays für Bindungs-, Lokalisierungs- oder funktionelle Nachweise.
- Operativer Wert: Die Elektroporation im 96-Loch-Format ermöglicht eine gleichmäßige Übertragung von DNA-Konstrukten und verbessert die Reproduzierbarkeit in transfektionsbasierten Screening-Plattformen.
- Skalierbarkeit: Die Kultivierung in 24-Loch-Platten unterstützt die isolierte Gewinnung einzelner Klone und deren Selektion und schafft eine nachwachsende Ressource für nachgeschaltete Zielvalidierungs-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Markierte Proteinstämme ermöglichen die Korrelation molekularer Phänotypen mit der Empfindlichkeit gegenüber Wirkstoffen und unterstützen biomarkerbasierte präklinische Modelle.
- Mechanistische Erkenntnisse: Erleichtert die Identifizierung von Protein-Komplexen und Signalwegen und hilft so, Wirkmechanismen und Resistenzmechanismen besser zu verstehen.
- Zielvalidität: Die endogene Markierung erhält die natürlichen Expressionsniveaus bei, verringert Artefakte und verbessert die Vorhersagekraft bei der Beurteilung der Essenzialität von Zielstrukturen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode ist in die Entdeckungsbiologie-Phase integriert, in der Hochdurchsatz-Markierung die Zielidentifizierung und -validierung vor der Leitstruktur-Optimierung unterstützt. Sie ermöglicht die Erzeugung von reaktionsfähigen Zelllinien für biochemische und zellbasierte Assays und schafft so eine Brücke von genomischen Treffern zur funktionellen Validierung. Ergebnisse wie Lokalisierungsmuster und Interaktionsnetzwerke fließen in Go/No-Go-Entscheidungen bei der Zielverfolgung ein.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch die Identifizierung der subzellulären Lokalisation und von Interaktionspartnern von Kandidatengenen aus genomischen Screens.
- Screening: Ermöglicht die Herstellung standardisierter, markierter Zelllinien für die reproduzierbare Entwicklung von Assays in Validierungskaskaden von Zielstrukturen.
- Analytik: Erzeugt quantitative bildgebende Verfahren und proteomiktaugliche Proben zur vergleichenden Analyse von Lokalisation, Expression und Interaktionszuständen unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die molekulare Zielstrukturvalidierung mit phänotypischen Ergebnissen durch markierte Zelllinien, die in Studien zur Arzneimittelwirkung und Resistenzentwicklung eingesetzt werden können.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Plasmid- und Primer-System ist auf verschiedene Gensätze übertragbar und ermöglicht die Wiederverwendung in mehreren Projekten, ohne die Kernkomponenten neu entwickeln zu müssen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung durch endogene, parallele Markierung, die den nativen Proteinkontext und die Funktion erhält.
- Operationaler Wert: Ein standardisierter Workflow für Elektroporation und Selektion in 96-Well-Platten verbessert die Reproduzierbarkeit und reduziert den manuellen Arbeitsaufwand pro Ziel.
- Strategischer Wert: Ermöglicht eine schnelle Skalierung der Zielvalidierungsbemühungen und verbessert die Kapitaleffizienz in der frühen Entdeckungsphase, indem die Ausscheidung in späteren Phasen aufgrund unzureichend validierter Ziele verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem multivariate Daten (Lokalisation, Interaktionen, Expression) zur informierten Rangfolge der Ziele bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert molekularbiologische Fachkenntnisse in der PCR-Primer-Design, Klonierung und Trypanosomen-Kultivierungstechniken.
- Basiert auf dem Zugang zu Elektroporationssystemen, die mit 96-Well-Plattenhandhabern und standardisierten Pulsparametern kompatibel sind.
- Setzt standardisierte Antibiotika-Selektions- und Rekonvaleszenzprotokolle voraus, um eine konsistente Gewinnung transgener Linien über alle Platten hinweg sicherzustellen.
- Die Anpassung an andere Markertypen (z. B. fluoreszierende, Affinitäts- oder Näherungsmarker) erfordert die Validierung der Markertauglichkeit und Verträglichkeit mit nachgeschalteten Assays.
- Der Erfolg hängt von einer sorgfältigen Verfolgung der Zuordnung von Vertiefung zu Gen während der Übertragungsschritte ab, um die Verknüpfung von Genotyp und Phänotyp aufrechtzuerhalten.
