Ein

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Auswirkungen auf die Integrität und Permeabilität von Endothelzellen infolge ihrer Interaktion mit aktivierten T-Zellen zu untersuchen. Diese Methode trägt dazu bei, zentrale Fragen im Bereich der Neuroimmunologie zu beantworten, beispielsweise wie die direkte Interaktion zwischen T-Zellen und Endothelzellen die Integrität und Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke beeinflusst. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine automatisierte, Echtzeit-Bewertung der Barrierefunktion ermöglicht, nachdem ge gezielt die Interaktion zwischen T-Zellen und Endothelzellen moduliert wurde.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie autoimmuner ZNS-Erkrankungen, da sie Einblicke in die T-Zell-vermittelte Blut-Hirn-Schranke-Störung bietet, einen entscheidenden Schritt in der Pathogenese solcher Krankheiten. Diese Methode konzentriert sich auf marine Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke während der EAE. Sie kann jedoch auch auf Ratten- oder menschliche Blut-Hirn-Schranke-Modelle sowie auf Studien anderer autoimmuner ZNS-Erkrankungen angewendet werden.

Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund möglicher Schwierigkeiten mit dem optimalen Zeitpunkt der kombinierten primären Endothelzellkultur und der T-Zell-Aktivierung Schwierigkeiten haben. Wir entwickelten diese Methode ursprünglich, als wir uns zum Ziel gesetzt hatten, die Auswirkungen unterschiedlicher Grade der T-Zell-Aktivierung auf die Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke während der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), einem Tiermodell der multiplen Sklerose, zu untersuchen. Eine visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da das Einrichten von T-Zell- und Endothelzell-Ko-Kulturen schwer zu erlernen ist, da anfängliche Variationen der T-Zellzahlen zwischen den Wells zu späteren Fehlinterpretationen der Ergebnisse führen können.

Um dieses Verfahren zu beginnen, beschichten Sie am fünften Tag nach der Isolierung von MBMECs die permeablen Einsätze mit jeweils 80 Mikrolitern MBMEC-Beschichtungslösung pro Einsatz. Inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für drei Stunden. Nach dem Entfernen der MBMEC-Beschichtungslösung von den Einsätzen waschen Sie die MBMECs, indem Sie zwei Milliliter PBS bei Raumtemperatur in jedes Loch geben, nach einer Minute abpipettieren und diesen Vorgang anschließend einmal wiederholen.

Fügen Sie anschließend 0,05 % Trypsin-EDTA mit 300 Mikroliter pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie fünf bis zehn Minuten lang. Danach geben Sie zwei Milliliter MBMEC-Medium in jede Vertiefung, um die Trypsinisierung zu stoppen. Überführen Sie anschließend die gesammelten Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Probe bei 700 × g für acht Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach acht Minuten den Überstand verwerfen und die Zellen in einem Milliliter MBMEC-Medium ohne Puromycin resuspendieren. Zum Zählen der Zellen 90 Mikroliter einer 0,04 %igen Trypanblaulösung mit 10 Mikrolitern Zellsuspension mischen und 10 Mikroliter der Mischung zwischen die Deckglasplatte und das Hämozytometer pipettieren.

Anschließend überführen Sie jeweils zwei mal 10 hoch vier Zellen pro Insert. Geben Sie 810 Mikroliter MBMEC-Medium in das untere Kompartiment jedes Wells und stellen Sie die Platte mit den Inserts bis zur Durchführung der TEER-Messung in den Inkubator. Zur Stimulation von CD4-positiven T-Zellen beschichten Sie eine rundbodige 96-Well-Platte mit gereinigtem anti-maus CD3-Antikörper in der gewünschten Endkonzentration für drei Stunden bei 37 Grad Celsius vor.

Nach der Isolierung der T-Zellen waschen Sie die vorbeschichtete Platte zweimal mit PBS. Geben Sie anschließend gereinigten anti-CD28-Antikörper in der gewünschten Endkonzentration zu den isolierten T-Zellen und mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie danach die T-Zellen für zwei bis drei Tage bei 37 Grad Celsius.

Um die TEER-Messung vorzubereiten, stellen Sie das 24-Loch-Modul des TEER-Instruments in die laminare Luftströmungskabine. Entfernen Sie die Deckel und setzen Sie die Inserts mit MBMECs mit einer Pinzette in das Instrument ein. Geben Sie anschließend 810 Mikroliter frisches Medium in den unteren Kompartiment der Modul-Vertiefungen, wobei das Medium vorsichtig zwischen den Insert und die Wand der Modul-Vertiefung pipettiert wird.

Danach schließen Sie die Deckel und stellen das Gerät in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät an den Computer an. Schalten Sie dann den Gerätecontroller ein und öffnen Sie die Software.

Wählen Sie im Popup-Fenster „Neue Messung“ aus, aktivieren Sie die Felder „TER anzeigen“ und „Ccl anzeigen“ und klicken Sie dann auf „Start“. Nach Abschluss der ersten Messung wählen Sie im Reiter „Ergebnisse“ die Option „Alle Wells auswählen“, um alle TEER- und Ccl-Werte anzuzeigen.

Speichern Sie anschließend die Datei. Wählen Sie danach den Zeitpunkt für die Koeinsaat von MBMECs mit T-Zellen, zu dem Ccl stabil ist und unter einem Mikrofarad pro Quadratzentimeter liegt und bei dem der TEER seinen Maximalwert erreicht hat. Überprüfen Sie sorgfältig die absoluten TEER- und Ccl-Werte und schließen Sie die Wells aus, in denen die MBMECs keine ausreichend konfluente Monoschicht ausgebildet haben, indem Sie diese Wells abwählen.

Gruppieren Sie die restlichen Wells, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Wells klicken und „Wells zur neuen Durchschnitts-Welle hinzufügen“ auswählen. Benennen Sie diese im Popup-Fenster und wiederholen Sie dies für alle einzelnen Wells, die gruppiert werden sollen. Überprüfen Sie anschließend alle Durchschnitts-Wellen, um sicherzustellen, dass alle die gleichen Anfangsbedingungen vor der Co-Kultur aufweisen. Wechseln Sie zum Reiter „Experiment“ und klicken Sie auf „Pause“.

Trennen Sie das Gerät vom Strom und nehmen Sie es aus dem Inkubator. Entfernen Sie anschließend die Deckel im laminarer Luftstrom-Schrank. Danach entnehmen Sie etwas Medium aus dem Insert im oberen Kammerabschnitt.

Geben Sie T-Zellen zu MBMECs hinzu, indem Sie vorsichtig 150 Mikroliter Medium pipettieren. Schließen Sie dann das Gerät wieder an und drücken Sie auf „Messung fortsetzen“. Nach 24 Stunden klicken Sie im Experiment-Tab auf „Stopp“ und speichern die Datei.

Hier ist die spindelförmige Morphologie in der immunfluoreszenzfarblichen Färbung von PECAM-1 und Cldn-5 fünf Tage nach der Isolierung von MBMECs dargestellt. Hier sind die TEER- und Ccl-Werte vor und nach der Gruppierung einzelner Vertiefungen vor der Zugabe von T-Zellen. Die blaue Kurve wird für das Experiment nicht verwendet, da die MBMECs in dieser Vertiefung keinen so hohen TEER wie in anderen Vertiefungen entwickelt haben.

In diesem Experiment wurden 35 bis 55 spezifische CD4-positive T-Zellen fünf Tage lang antigenspezifisch stimuliert. Naive T-Zellen und proinflammatorische Zytokine, Interferon-Gamma und TNF-alpha, dienten als negativer bzw. positiver Kontrollwert. Hier wurden T-Zellen durch die gleiche Menge an Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern stimuliert, und diejenigen, die drei Tage lang kultiviert wurden, zeigten eine stärkere Neigung zur Barrierestörung im Vergleich zu den T-Zellen, die nur zwei Tage lang kultiviert wurden.

Die hier gezeigten Ergebnisse zeigen, dass stimulierte T-Zellen, jedoch nicht deren Überstände, eine erhebliche Schädigung der MBMECs verursachten, was darauf hinweist, dass der direkte Kontakt zwischen T-Zellen und MBMECs für die Barrierestörung entscheidend ist. Andererseits führte die Zugabe von Granzym-B-Inhibitor 2 zur Kultur der T-Zellen zu einer stärkeren Wiederherstellung der MBMEC-Integrität, was auf das zytolytische Molekül als wichtigen Faktor bei der Schädigung der MBMECs und dem anschließenden Abfall des TEER-Werts hinweist. Wenn der Versuch einmal beherrscht ist, kann er bei korrekter Durchführung innerhalb von 12 Tagen durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, den richtigen Zeitpunkt für die Einrichtung der Kokultur von T-Zellen und Endothelzellen zu wählen.

Mit dieser Methode können weitere Analysen durchgeführt werden, wie beispielsweise Immunfluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie und Probabilitätsanalysen. Um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie beeinflusst diese Interaktion die Expression von Tight-Junction-Molekülen, die Permeabilität und das Ausmaß der T-Zell-Transmigration? Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Neuroimmunologie den Weg, autoimmune Erkrankungen des Zentralnervensystems bei Mäusen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die direkten Effekte zwischen aktivierten T-Zellen und endothelialen Zellen bezüglich der Integrität und Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke beurteilt.