Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen
11. November 2016
Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion
.Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die parallele Beurteilung der zirkadianen Biolumineszenz und der sekretorischen Aktivität von humanen primären endokrinen Zellen, die en vitro kultiviert und synchronisiert werden. Diese Methode kann helfen, das zeitliche Muster der Zellsekretion zu untersuchen und wie es durch zellautonome zirkadiane Uhren reguliert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die zirkadianen Luciferine als Reporteraktivität zu überwachen und gleichzeitig das Ausflussmedium zu sammeln, um die Spiegel der sezernierten Hormone und Myokine zu messen. Um zirkadiane Biolumineszenz-Reporter durch lentivirale Transduktion in die Primärzellen einzuführen, werden zunächst die 3,5 cm großen Petrischalen mit humanen Myoblasten mit einer Konfluenz von 30 % bis 50 % in einen Laminar-Flow-Schrank überführt. Ersetzen Sie das humane Myoblastenmedium durch 2 ml Wachstumsmedium. Transduzieren Sie dann die primäre Zellkultur, indem Sie Lentiviruslösung in die Schale pipettieren, um eine Infektionsvielfalt von gleich drei zu erhalten. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator. Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium. Um eine En-vitro-Synchronisation zu erreichen, fügen Sie 10 mikromolare Adenylylcyclase-Aktivatoren in 2 ml Medium pro 3,5 cm Petrischale hinzu, die die zuvor transfizierten Primärzellen enthält. Inkubieren Sie die Zellen 60 Minuten lang bei 37
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Übersicht
Diese Studie beschreibt Methoden zur gleichzeitigen Überwachung der circadianen Biolumineszenz und der sekretorischen Aktivität menschlicher Inselzellen sowie primärer Myotuben. Der Ansatz umfasst die lentivirale Genübertragung eines Luciferase-basierten Kernuhr-Reporters, gefolgt von einer in-vitro-Synchronisierung und kontinuierlichen Perifusion der Zellen zur Sammlung des Kulturmediums.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Chronobiologie
Hintergrund
- Zirkadiane Rhythmen spielen eine entscheidende Rolle bei zellulären Funktionen.
- Die Überwachung der Biolumineszenz kann Einblicke in die zelluläre Aktivität liefern.
- Menschliche Inselzellen sind für die Insulinsekretion unerlässlich.
- Primäre Myotuben sind wichtig für die Untersuchung der Muskelphysiologie.
Zweck der Studie
- Untersuchung des Zusammenhangs zwischen circadianen Rhythmen und sekretorischer Aktivität.
- Entwicklung einer Methode zur Echtzeitüberwachung zellulärer Funktionen.
- Verbesserung des Verständnisses metabolischer Prozesse in menschlichen Zellen.
Verwendete Methoden
- Lentivirale Gentransfer zur Expression eines Luciferase-Reportergens.
- In-vitro-Synchronisierung von Zellkulturen.
- Kontinuierliche Perfusionskultur zur Sammlung des Kulturmediums.
- Biolumineszenzmessung zur Beurteilung zirkadianer Rhythmen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Überwachung der circadianen Biolumineszenz in menschlichen Inselzellen.
- Nachgewiesene sekretorische Aktivität primärer Myotube.
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung zellulärer Rhythmen.
- Gewonnene Erkenntnisse über das Zusammenspiel zwischen circadianer Biologie und zellulärer Funktion.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet einen neuartigen Ansatz, um zelluläre Aktivitäten in Echtzeit zu überwachen.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der circadianen Einflüsse auf den Stoffwechsel bei.
- Mögliche Anwendungen in der Diabetesforschung und der Muskelphysiologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die parallele Messung der Expression von circadianen Uhr-Genen und der Hormonsekretion in humanen primären Zellkulturen ermöglicht eine direkte Untersuchung der zeitlichen Regulation in menschlichen endokrinen und muskulären Systemen. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem molekulare circadiane Oszillatoren mit funktionellen sekretorischen Ausgängen verknüpft werden. Die Integration dieser Messungen in der Entdeckungsphase unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Programmen im Bereich Stoffwechsel und Chronobiologie über das gesamte Portfolio hinweg.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die mechanistische Ent风险bewertung durch Korrelation der Clock-Genaktivität mit der Sekretion von Hormonen und Myokinen in primären humanen Zellen.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung durch Störung zentraler Clock-Gene und Quantifizierung nachgeschalteter sekretorischer Effekte.
- Erleichtert eine vorhersagbare Sicherheit bei der Auswahl von Signalwegen für metabolische und endokrine Targets.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte, synchronisierte primäre Zellsysteme für die robuste Entwicklung von Assays.
- Liefert quantitative, zeitlich aufgelöste Messungen sowohl der Genexpression als auch der sekretorischen Aktivität.
- Ermöglicht die reproduzierbare Beurteilung der Wirkung von Substanzen oder genetischen Störungen auf zirkadianregulierte Ausgangssignale.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimmt in vitro-Befunde durch die Verwendung primärer Insel- und Muskelzellen mit der krankheitsrelevanten menschlichen Physiologie ab.
- Unterstützt die translationale Biomarker-Entdeckung, indem molekulare Uhrenstörungen mit funktionellen Sekretionsphänotypen verknüpft werden.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung in der Stoffwechsel- und Chronobiologie-Forschung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode verbindet die frühe Entdeckung mit der präklinischen Forschung, indem sie die Hypothesenprüfung der zirkadianen Regulation in humanen primären Zellen ermöglicht und sowohl die Zielvalidierung als auch die translationale Kontinuität unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die direkte Untersuchung der Funktion zirkadianer Gene und deren Auswirkung auf sekretorische Signalwege.
- Screening: Bietet synchronisierte, versuchsbereite Primärzellmodelle mit quantitativen Ausgaben zur Wirkstoffbewertung.
- Analytik: Erzeugt zeitlich aufgelöste Biolumineszenz- und Sekretionsdaten für robuste statistische Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet Störungen des molekularen Uhrwerks mit krankheitsrelevanten sekretorischen Phänotypen in menschlichen Zellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung zirkadianer Regulation in verschiedenen Primärzelltypen und Zielstrukturen bereit.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Zielvalidierung.
- Operativer Wert: Standardisiert langfristige, parallele Messabläufe in primären humanen Zellen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung von Projekten, indem molekulare und funktionelle Ergebnisse in krankheitsrelevanten Systemen verknüpft werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Programmen im Bereich Stoffwechsel und Chronobiologie.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der lentiviralen Transduktion, der Kultur primärer Zellen und der Messung von Biolumineszenz.
- Benötigt Zugang zu synchronisierten Perfusionssystemen und empfindlichen Assays für Hormone bzw. Myokine.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um reproduzierbare Zeitreihendaten zu erhalten.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für verschiedene Typen primärer Zellen oder sekretorische Endpunkte notwendig.
- Die Langzeitkultur und die Stabilität des Reporters müssen für jede Anwendung validiert werden.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
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Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
