Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens bestehen darin, eine unkonventionelle intraepitheliale Zellpopulation, die aus Gamma-Delta-T-Zellen, aus einer humanen Endozervixabstrichprobe zu isolieren und zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zum Verständnis der immunologischen Vorgänge im intraepithelialen Kompartiment der Endozervix zu beantworten und somit bei der Entwicklung effektiver Strategien zur Prävention von Infektionen unterstützen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein leistungsfähiges und effizientes Werkzeug zur Untersuchung endozervikaler intraepithelialer Gamma-Delta-T-Lymphozyten in vitro bietet.

Den Vorgang wird Laura Romero, eine leitende wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstrieren. Unmittelbar nach der Sammlung das Röhrchen mit dem Zytobürstchen auf Eis stellen. Innerhalb einer Stunde nach der Sammlung das Röhrchen mit dem Zytobürstchen viermal für jeweils 10 Sekunden vortexen.

Anschließend zentrifugieren Sie das Röhrchen und entfernen vorsichtig den Bürstenaufsatz, ohne die Palette zu stören. Geben Sie danach ein Milliliter IMDM-Medium zu den Zellen und stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Legen Sie die Zellbürste auf einen 100-Millimeter-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Konusröhrchen und spülen Sie die Bürste mit 20 Milliliter frischem IMDM aus.

Zentrifugieren Sie die Waschflüssigkeit. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem IMDM und vereinigen Sie die Waschflüssigkeit mit den Zellen im ursprünglichen Zytobürsten-Sammelröhrchen. Um die endozervikalen Zellen per Durchflusszytometrie zu analysieren, pipettieren Sie jeweils ein- bis dreimal 10 hoch 5 Zellen in 100 Mikroliter FACS-Puffer pro Fünf-Milliliter-Röhrchen und markieren Sie die Zellen mit den gewünschten Antikörpern und einer Vitalitätsfarbe 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln.

Am Ende der Inkubation die Zellen in einem Milliliter Puffer des Kits waschen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen das Überstand vollständig entfernen. Verwenden Sie die Kügelchen und die entsprechenden IgG-Kontrollantikörper, um die Kompensationskontrollen einzurichten.

Danach die erste Röhre laden und das Tor auf die gesamte Endozervixzellpopulation in einem Vorwärts- durch Seitenstreuplot setzen, gefolgt von der Ausschließung von Zell-Doubletten. Ausschluss der toten Zellen entsprechend ihrer Expression des Vitalitätsfarbstoffs, wobei auf lebende CD45-positive und CD3-positive Zellen getor wird. Die gamma-delta-1- und gamma-delta-2-positiven Zellen werden als Teilpopulationen der CD3-positiven Zellen definiert, die den gamma-delta-TCR exprimieren.

Um die Gamma-Delta-T-Zellen mittels magnetischer Bead-Isolierung zu gewinnen, resuspendieren Sie bis zu 1 × 10⁷ frisch gewonnene endozervikale Zellen in 40 µl Puffer des TCR-gamma-delta-MicroBead-Kits. Laut Herstelleranleitung für das zweistufige Färbeprotokoll werden die Zellen zunächst mit einem anti-TCR-gamma-delta-Hapten-Antikörper und anschließend mit FITC-konjugierten anti-Hapten-MicroBeads für 15 Minuten bei 4 bis 8 °C markiert. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit 1 ml des Kit-Puffers und dekantieren das Überstand vollständig.

Suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikroliter Kit-Puffer und geben Sie die Zellsuspension direkt auf eine magnetische Säule, die in dem entsprechenden Trennmagneten befestigt ist. Sammeln Sie den Durchlauf in einem neuen Röhrchen. Nachdem alle Zellen durch die Säule gelaufen sind, waschen Sie die Säule dreimal mit jeweils 500 Mikroliter frischem Puffer und vereinigen Sie die Waschfraktionen mit den gesammelten Zellen. Um die Gamma-Delta-T-Zellen zu gewinnen, überführen Sie die Säule in ein kegelförmiges Röhrchen und spülen Sie die T-Zellen mithilfe des Säulenstößels mit einem Milliliter frischem Puffer aus der Säule.

Um die Gamma-Delta-T-Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren, markieren Sie die Zellen mit einem Vitalitätsfarbstoff, wie im zuvor gezeigten Antikörpanel. Anschließend sortieren Sie die Zellen entsprechend ihrer Vitalitätsfärbung sowie ihres CD45-, CD3- und Gamma-Delta-Positivität. Eine einzigartige Population von Gamma-Delta-V1-exprimierenden T-Zellen kann in menschlichen Endozervix-Zellproben leicht nachgewiesen werden.

Eine detaillierte phänotypische Analyse der selektierten CD3-positiven, Gamma-Delta-1-positiven Zellen zeigt, dass der Großteil dieser Zellen negativ für CD4 und CD8 ist. Die Trennung der endozervikalen Zellen mittels magnetischer Sphären, wie gerade gezeigt, führt zur Anreicherung einer nahezu 98 % reinen Population dieser T-Zell-Rezeptor-Gamma-Delta-Zellen. Dieser Reinheitsgrad kann ebenfalls mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung erreicht werden, wodurch die Verwendbarkeit beider Methoden zur Isolierung endozervikaler Gamma-Delta-T-Zellen bestätigt wird.

Interessanterweise zeigt die Analyse von endozervikalen intraepithelialen Zellen, Gamma-Delta-T-Zellen, die von HIV-infizierten weiblichen Patientinnen und gesunden Spenderkontrollen gewonnen wurden, eine leichte Verringerung der Anzahl und Vitalität dieser wichtigen Zellen bei HIV-infizierten Individuen. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Probe schnell zu verarbeiten und die Zellen während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten, um eine gute Zellvitalität zu gewährleisten.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Einzelzellselektion in Kombination mit einer hochsensitiven, durchflussbasierten Multiplex-PCR angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu den entzündlichen und Signalwegen im endozervikalen intraepithelialen Kompartiment zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet von HIV und Infektionskrankheiten den Weg, um neuartige Zellmarker für die Schleimhautanfälligkeit zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man intraepitheliale Lymphozyten aus einer humanen endozervikalen Abstrichprobe präpariert.