Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, nach Erregern zu suchen, die von einem Bakterienstamm produziert werden und gegen den zweiten Bakterienstamm hemmend wirken. Diese Methode kann helfen, Fragen in einer Reihe von mikrobiologischen Bereichen zu beantworten, ist aber besonders nützlich in der mikrobiellen Ökologie, um antagonistische bakterielle Wechselwirkungen zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie kostengünstig und einfach durchzuführen und zu interpretieren ist.

Das Verfahren wird von Aretha, einer Studentin im Labor, demonstriert. Um das Experiment zu beginnen, inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von P-Syringae in 3 Milliliter King's Medium B-Brühe oder KB. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht. Am nächsten Morgen verdünnen Sie die Brühekultur bei 1 bis 100 in 3 Milliliter frische KB-Brühe.

Inkubieren Sie die Kultur drei bis vier Stunden lang unter Schütteln bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Trübung der Kultur merklich zunimmt, und fügen Sie dann Mitomycin C hinzu. Inkubieren Sie die Kultur anschließend über Nacht unter Schütteln bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag pelletieren Sie ein bis zwei Milliliter Mitomycin C-induzierte Kulturen in einer Mikrozentrifuge.

Entfernen und sterilisieren Sie die Kulturüberstände, indem Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikrometer-Filter mit Porengröße leiten. Natriumchlorid wird hinzugefügt, um eine molare Konzentration zu erreichen, und Polyethylenglykol oder PEG 8000 wird dem sterilen Überstand mit einer Endkonzentration von 10 % zugesetzt. Die Proben werden wiederholt invertiert, bis sowohl das Natriumchlorid als auch das PEG vollständig aufgelöst sind.

Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang in einem Eisbad. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben. Nach dem Schleudern den Überstand dekantieren und das Pellet durch wiederholtes Pipettieren wieder in Puffer suspendieren.

Entfernen Sie das restliche PEG durch zwei aufeinanderfolgende Extraktionen mit gleichem Volumen an Chloroform. Kombinieren Sie es mit Chloroform mit dem resuspendierten Pellet und wirbeln Sie die Mischung 15 Sekunden lang ein. Dann zentrifugieren Sie die Mischung bei 20.000 mal G für fünf Minuten.

Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Mikrofuge-Röhrchen. Diese Extraktion wird zweimal wiederholt, bis keine weiße Grenzfläche mehr zwischen der wässrigen und der organischen Phase sichtbar ist. Restliches Chloroform aus extrahierten Überständen in einem Abzug verdampfen lassen.

Eine einzelne Kolonie eines P-syringae-Stammes wird in drei Milliliter KB geimpft und die Kultur über Nacht unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Morgen verdünnen Sie die Kultur 1 bis 100 in frisches KB. Inkubieren Sie die Kultur drei bis vier Stunden lang unter Schütteln bei Raumtemperatur. Bereiten Sie als Nächstes sterilisierten Wasseragar vor, indem Sie eine Agarsuspension in ultrareinem Wasser autoklavieren.

Bewahren Sie den geschmolzenen weichen Agar vor der Verwendung in einem 60 Grad Celsius warmen Wasserbad auf. Mit einer sterilen serologischen Pipette werden drei Milliliter weicher Agar in ein steriles Kulturröhrchen überführt. Stellen Sie das Kulturrohr wieder in das Wasserbad, um es in einem geschmolzenen Zustand zu halten.

Lassen Sie den geschmolzenen Agar vor dem Gießen des Overlays abkühlen, aber lassen Sie ihn nicht erstarren. Es ist wichtig, dass der Agar vor der Inokulation in einem heißen, vollständig geschmolzenen Zustand gehalten wird. Ist dies nicht der Fall, sieht das Overlay körnig aus und ist schwieriger zu interpretieren.

Impfen Sie in einer sterilen Haube 100 Mikroliter der Testerstammkultur in den weichen Agar und den Wirbel, um ihn zu mischen. Drehen Sie die Kultur 10 bis 15 Sekunden lang von Hand und gießen Sie sie dann auf den Boden einer Agarplatte. Kippen Sie die Platte in alle Richtungen, um sicherzustellen, dass der weiche Agar den unteren Agar gleichmäßig bedeckt.

Decken Sie die Platte ab und lassen Sie sie 20 bis 30 Minuten fest werden. Achten Sie darauf, die Platte beim Erstarren nicht zu stören. Sobald es erstarrt ist, tupfen Sie zwei bis fünf Mikroliter Überstand auf die Überlagerung.

Lassen Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Beobachten und notieren Sie die Ergebnisse am nächsten Morgen. Bei dieser Methode werden zwei Stämme von P-Syringae durch unterschiedliche Bakteriozine gehemmt.

Stamm A ist empfindlich gegenüber einem hochmolekularen Bacteriocin-Tailocin, aber nicht empfindlich gegenüber einem alternativen, niedermolekularen Bacteriocin. Umgekehrt ist Stamm B unempfindlich gegenüber dem Tailocin, aber empfindlich gegenüber dem niedermolekularen Bacteriocin. Das Tailocin wird nach der PEG-Fällung effizient zurückgewonnen, während dies bei Bacteriocinen mit niedrigerem Molekulargewicht nicht der Fall ist.

Die Bakteriophagen-vermittelte Abtötung wird von anderen nicht-replikativen antimikrobiellen Mitteln durch den Vergleich einer Verdünnungsreihe unterschieden. Im Falle der Bakteriophagen-vermittelten Klärung löste sich die Verdünnung des Überstands in einzelne Plaques oder Clearing-Zonen auf, während sich die Bacteriocin-vermittelte Klärung nicht in solche Plaques auflöste. Dieses Verfahren kann als erstes Screening zur Identifizierung von Hemmstoffen verwendet werden und kann mit nachgelagerten genetischen Manipulationen kombiniert werden, um die Quelle dieser Aktivität zu identifizieren oder zu bestätigen.