Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern
2. Oktober 2017
Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.
Das übergeordnete Ziel des sequentiellen Salzextraktionsverfahrens ist es, Proteinbindungsprofile an Bulk-Chromatin zu charakterisieren und zu bewerten, wie die Bindung verändert wird, wenn das Protein oder seine Umgebung manipuliert wird. Diese Methode misst die relative Affinität epigenetischer Regulatoren zum Chromatin und kann verwendet werden, um zu bewerten, wie sich diese Wechselwirkungen durch genetische, chemische und umweltbedingte Manipulation ändern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit ist, die Bindungsprofile von Chromatin-bindenden Proteinen zu bewerten.
Personen, die neu auf dem Gebiet des Chromatins sind, haben oft Probleme mit der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP). Die sequentielle Salzextraktion ist eine alte Technik, mit der selbst unerfahrene Wissenschaftler viele der gleichen Fragen beantworten können. Um das Verfahren zu beginnen, ernten Sie 8.000.000 Zellen aus jeder Zelllinie von Interesse.
Waschen Sie jede Zellprobe zweimal mit fünf Millilitern eiskaltem PBS. Resuspendieren Sie jede Probe und einen Milliliter eines hypotonen Puffers mit Proteaseinhibitoren. Übertragen Sie die Zellsuspensionen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Drehen Sie die Suspensionen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius von oben nach unten und zentrifugieren Sie die Suspension dann fünf Minuten lang bei derselben Temperatur bei 6.000 g. Entsorgen Sie den Überstand. Statten Sie eine Mikropipette mit einer Ein-Milliliter-Spitze aus.
Dem Pellet werden 200 Mikroliter salzfreier modifizierter Ripa-Puffer mit Proteasehemmern zugesetzt. Klopfen Sie mit der Pipettenspitze gegen den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens, um das Pellet in die Spitze zu ziehen. Pipettieren Sie das Pellet 15 Mal auf und ab.
Die Probe sollte dick und klebrig werden, wenn das Pellet aufbricht. Homogenisieren Sie jede Probe auf diese Weise und inkubieren Sie die Proben drei Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie dann die Proben bei 6500 g bei vier Grad Celsius für drei Minuten.
Übertragen Sie die Überstände in saubere 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zu jedem Pellet werden 200 Milliliter modifizierter Ripa-Puffer mit 100 millimolaren Natriumchlorid und Proteaseinhibitoren gegeben. Pipettieren Sie das Pellet 15 Mal auf und ab.
Wenn sich das Pellet anfangs nur schwer in die Pipettenspitze ziehen lässt, klopfen Sie mit der Spitze an der Unterseite des Röhrchens an. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Probe und inkubieren Sie die Proben drei Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Proben drei Minuten lang bei 6500 g bei vier Grad Celsius.
Übertragen Sie die Überstände auf neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Setzen Sie die Extraktion der Proben in modifizierte Ripa-Pufferlösungen mit steigenden Natriumchloridkonzentrationen fort. Wenn das Pellet nicht mehr am Boden des Röhrchens verbleibt, legen Sie das Pellet in den Deckel des Zentrifugenröhrchens, bevor Sie den Überstand umfüllen.
Nach der seriellen Salzextraktion werden für jede Probe 70 Milliliter des vierfachen Proteinbeladungsfarbstoffs zu jeder der fünf Überstandsfraktionen hinzugefügt. Laden Sie 30 Mikroliter jeder Fraktion auf ein SDS-Acrylamidgel. Führen Sie einen Standard-Western-Blot durch, indem Sie die Proteine auf eine Membran übertragen und mit den entsprechenden Primärantikörpern färben.
Inkubieren Sie den Blot in Sekundärantikörpern, die mit einem Infrarotfarbstoff markiert sind, und bilden Sie den Blot ab. Verwenden Sie eine Bildanalysesoftware, um die Bandenintensität jeder Salzkonzentration zu berechnen. Plotten Sie die Bandenintensität gegen die Salzkonzentration auf, um das Elutionsmuster des interessierenden Proteins zu bestimmen.
Die sequentielle Salzextraktion der Proteine ARID1a und Polybromo 1 zeigte eine konsistente Elution mit Salzkonzentrationen von 200 bzw. 300 Millimolar. Die nicht-sequentielle Salzextraktion der gleichen Proteine zeigte weniger konsistente Ergebnisse. Die Inkubationszeit muss für jedes untersuchte Protein optimiert werden.
Daher wurde SSE verwendet, um Elutionsprofile nach unterschiedlichen Inkubationslängen zu untersuchen. Ein transkriptioneller Aktivator, Polybromo 1, zeigte ähnliche Elutionsprofile, wenn er drei Minuten und 10 Minuten inkubiert wurde. Der Transkriptionsrepressor, Polycomb Repressive Complex 1, angezeigt durch BMI1, benötigte mehr als drei Minuten, um aus dem Chromatin freigesetzt zu werden.
Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden untersucht, indem die Veränderung der Elutionsprofile untersucht wurde. In Gegenwart eines Inhibitors trat die Bromodomäne, die das Protein vier enthält, bei niedrigeren Salzkonzentrationen auf als ohne den Inhibitor. Unterschiede in den Histonmustern wurden beobachtet, wenn Zellen mit einem Histon-Deacetylase-Inhibitor behandelt wurden, wodurch sich die Landschaft des Chromatins veränderte.
Veränderungen in der Proteinbindung, wenn Zellen genomischem Stress ausgesetzt waren, spiegelten sich auch in den Elutionsprofilen wider. Hier deutete die Erhöhung der Salzkonzentration, die für die Elution benötigt wird, darauf hin, dass Polybrom 1 nach einer DNA-Schädigung mit Doxorubicin fester an das Chromatin bindet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens daran, jede Probe so konsequent wie möglich zu behandeln. Dieses Verfahren kann in den ersten Schritten einer Studie eingesetzt werden, um den Mechanismus und die Regulation eines Chromatin-bindenden Proteins aufzuklären. Dies spart Zeit und Geld für unnötige genomweite Studien.
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Übersicht
Das sequenzielle Salzextraktionsverfahren dient dazu, die Bindungsprofile von Proteinen an Bulk-Chromatin zu charakterisieren und zu bewerten, wie diese Bindungen durch verschiedene experimentelle Manipulationen verändert werden. Diese Methode eignet sich besonders zur Beurteilung der Affinität epigenetischer Regulatoren zum Chromatin.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Chromatinbiologie
- Proteinwechselwirkungen
- Epigenetik
Hintergrund
- Die sequenzielle Salzextraktion ist eine Technik zur Untersuchung von Chromatin-bindenden Proteinen.
- Sie bietet eine schnelle und kostengünstige Alternative zur chromatinimmunpräzipitation (ChIP).
- Diese Methode ist auch für unerfahrene Wissenschaftler zugänglich.
- Sie ermöglicht die Bewertung, wie sich Proteinwechselwirkungen in Abhängigkeit von genetischen, chemischen und umweltbedingten Faktoren verändern.
Zweck der Studie
- Charakterisierung der Bindungsprofile von Chromatin-bindenden Proteinen.
- Beurteilung der Auswirkungen verschiedener Manipulationen auf die Proteinbindung.
- Vorstellung einer einfachen Methode für Forscher im Bereich Chromatin.
Verwendete Methoden
- Isolierung von 8.000.000 Zellen aus jeder gewünschten Zelllinie.
- Schrittweise Salzextraktion zur Isolierung chromatingebundener Proteine.
- Bestimmung der Proteinbindungsaffinität zum Chromatin.
- Untersuchung von Veränderungen in den Bindungsprofilen unter verschiedenen Bedingungen.
Hauptergebnisse
- Die Methode charakterisiert effektiv Protein-Bindungsprofile.
- Sie zeigt, wie Bindungsaffinitäten durch Umweltfaktoren verändert werden können.
- Die Ergebnisse deuten auf die Nützlichkeit dieser Technik sowohl für erfahrene als auch für unerfahrene Forscher hin.
- Liefert Einblicke in die Wechselwirkungen epigenetischer Regulatoren mit Chromatin.
Schlussfolgerungen
- Die sequenzielle Salzextraktion ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Chromatin-Wechselwirkungen.
- Die Methode ist effizient und für verschiedene Forschungsanwendungen zugänglich.
- Sie verbessert das Verständnis der Proteingebindungsdynamik in der Chromatinbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die sequenzielle Salzextraktion (SSE) bietet eine schnelle und kostengünstige Methode zur Beurteilung der Affinität chromatinbindender Proteine und ermöglicht eine Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium der entwicklung von Wirkstoffen, die auf die Epigenetik abzielen. Indem quantifiziert wird, wie genetische, chemische oder umweltbedingte Störungen die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Chromatin verändern, unterstützt die SSE die mechanistische Absicherung chromatinmodifizierender Komplexe, bevor aufwändige Assays durchgeführt werden. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitstrukturen, indem direkte Bindungseffekte von indirekten zellulären Reaktionen unterschieden werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Misst relative Änderungen der Bindungsaffinität, wenn Komplex-Untereinheiten verloren gehen oder Domänen inaktiviert werden, und verdeutlicht so die funktionellen Beiträge einzelner Proteine zur Chromatinbindung.
- Wissenschaftlicher Wert: Profiliert Elutionsmuster unter steigenden Salzkonzentrationen, um spezifische Chromatinbindung von unspezifischen Assoziationen zu unterscheiden, wodurch falsch-positive Ergebnisse bei der Zielvalidierung reduziert werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht es Nicht-Experten, quantitative Bindungsdaten ohne spezialisierte ChIP-Kenntnisse zu erzeugen und beschleunigt so die Hypothesentestung in frühen Entwicklungsstadien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt reproduzierbare Elutionsprofile, die als quantitative Messgrößen zur Untersuchung der Wirkung von Substanzen auf chromatinbasierte Veränderungen dienen.
- Operativer Wert: Nutzt die Standardinfrastruktur für Western Blot und Bildanalyse, was die Assay-Standardisierung zwischen verschiedenen Laboren erleichtert und die technische Variabilität verringert.
- Operativer Wert: Benötigt lediglich grundlegende Zentrifugier- und Elektrophoresegeräte, wodurch die Einführung in Screening-Verfahren für epigenetische Modulatoren vereinfacht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet Veränderungen im Chromatin-Umfeld (z. B. durch HDAC-Hemmer) mit Veränderungen der Proteinbindung und unterstützt so mechanistische, biomarkerbasierte Studien in krankheitsrelevanten Systemen.
- Wissenschaftlicher Wert: Bewertet Bindungsverschiebungen unter genomischem Stress (z. B. durch Doxorubicin induzierte DNA-Schäden) und liefert damit Daten für prädiktive Modelle der Targetbindung unter pathophysiologischen Bedingungen.
- Operativer Wert: Ergänzt zelluläre und biochemische Assays, indem er eine orthogonale Validierung der Kontinuität von Chromatin-Wechselwirkungen von der Entdeckungsphase bis in die präklinische Entwicklung bietet.
Pipeline- und Workflow-Integration
SSE fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein und bietet eine mechanistische Brücke zwischen biochemischen Bindungsassays und zellulären phänotypischen Messungen in epigenetischen Programmen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem quantifiziert wird, wie komplexe Veränderungen die Chromatinbindung beeinflussen, wodurch Signalwege geklärt und epigenetische Zielstrukturen biologisch entrisikot werden können.
- Screening: Liefert salzabhängige Elutionsprofile als quantitative Ausgabe zur Vergleichbarkeit von durch Verbindungen induzierten Chromatinzustandsänderungen über verschiedene Screening-Kampagnen hinweg.
- Analytik: Erzeugt Bandintensitätsdaten, die gegen die Salzkonzentration aufgetragen werden und berechenbare Verschiebungen der Bindungsaffinität liefern, die für struktur-aktivitätsbezogene Diskussionen herangezogen werden können.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Bindungsänderungen mit Modifikationen des zellulären Chromatinlandschaftsprofils und unterstützt so die Abstimmung translationaler Biomarker, wenn sie mit funktionellen Endpunkten kombiniert wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine standardisierte, kostengünstige Methode dar, die auf mehrere Chromatinziele anwendbar ist und die Plattformwiederverwendung in epigenetischen Wirkstoffentwicklungsprozessen fördert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem direkte Chromatinbindung von indirekten zellulären Effekten durch kontrollierte Salzelution unterschieden wird.
- Operationaler Wert: Liefert reproduzierbare, quantitative Bindungsprofile unter Verwendung weit verbreiteter Laborgeräte und verbessert so die Standardisierung zwischen Teams.
- Strategischer Wert: Verringert die Abhängigkeit von niedrigdurchsatzfähigen ChIP-Analysen für erste Bindungsbeurteilungen und steigert damit die Kapitalwirtschaftlichkeit in frühen Epigenetik-Projekten.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Targets, die chromatinmodifizierende Komplexe darstellen, basierend auf der quantitativen Bindungsstabilität gegenüber umweltbedingten Störungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Chromatin-Biochemie und der Quantifizierung von Western Blots, um eine genaue Interpretation des Elutionsprofils sicherzustellen.
- Hängt vom Zugang zu gekühlten Zentrifugen, Mikrozentrifugenröhrchen und Standardausrüstung für SDS-PAGE/Western Blot ab.
- Setzt standardisierte Protokolle für die Zellernte und Zelllyse voraus, um die Variabilität zwischen Proben zu minimieren und vergleichbare Ergebnisse bei der Salzextraktion zu gewährleisten.
- Erfordert die Optimierung der Inkubationszeiten für jedes Zielprotein, da sich die Kinetik der Bindungsauflösung zwischen verschiedenen chromatinmodifizierenden Komplexen unterscheidet.
- Auf relative Affinitätsvergleiche beschränkt; absolute Bindungskonstanten erfordern zur Validierung orthogonale biophysikalische Methoden.
