Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung Drosophila Neuromuskuläre Junction Morphology

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die morphologischen Merkmale der neuromuskulären Verbindung von Drosophila mit Hilfe morphometrischer Software-Makros automatisch zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Regulatoren der Synapsenentwicklung zu identifizieren, eine Schlüsselfrage der Neurobiologie. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die automatische Quantifizierung mehrerer NMJ-Merkmale.

Dies ermöglicht eine objektive Analyse der NMJ-Morphologie im Hochdurchsatz. Wir haben uns entschieden, diese Methodik zu entwickeln, um die NMJ-Morphologie in einer großen Anzahl von Krankheitsmodellen untersuchen zu können. Wir haben uns überlegt, wie wir persönliche Differenzen verhindern und den Quantifizierungsprozess erheblich beschleunigen können.

visuelle Demonstration dieser Methode ist sehr hilfreich. Geeignete Makroeinstellungen sind von entscheidender Bedeutung, und einige Schritte können für neue Benutzer schwierig sein, insbesondere wenn sie mit VT-Software nicht vertraut sind. Generieren Sie für dieses Protokoll Bildstapel von NMJs und speichern Sie sie als einzelne TIFF-Dateien, wobei Kanal eins die DLG1-Färbung oder einen ähnlichen Marker und Kanal zwei die BRP-Färbung zeigt.

Erstellen Sie zunächst C-Projektionen und Hyperstapel der NMJ-Bilddateien. Öffnen Sie die Plugin-Optionen und wählen Sie Drosophila NMJ Morphometrics. Identifizieren Sie nun die eindeutige Dateizeichenfolge, die das Mikroskop den Bildserien zugewiesen hat, wenn sie als TIFF gespeichert werden.

Dies befindet sich am Ende des Bildnamens. Kopieren Sie die Zeichenfolge, die der untersten Ebene und der Kanalnummer zugewiesen wurde, und fügen Sie sie in das eindeutige Fenster zur Einstellung der Dateizeichenfolge ein. Wählen Sie dann das Untermakro convert to stack (In Stack konvertieren) und wählen Sie das Verzeichnis oder den Ordner aus, in dem sich die Bilder befinden.

Für jede Image-Datei werden zwei neue Dateien mit den Standardnamen Stack und Flat Stack erstellt, gefolgt vom ursprünglichen Image-Namen. Die Originaldateien können dann gelöscht werden, um Speicherplatz zu sparen. Wählen Sie als Nächstes in der Drosophila NMJ Morphometrics-Schnittstelle das Untermakro "ROI definieren" aus und wählen Sie das Bilddateiverzeichnis aus.

Wenn die erste Projektion geöffnet wird, wählen Sie das Freihandauswahlwerkzeug aus. Definieren Sie dann mit der Maus einen Bereich, der ein vollständiges NMJ-Terminal von Interesse enthält. Klicken Sie nach der Auswahl im Fenster "Terminal definieren" auf OK.

Fahren Sie damit fort, bis die NMJ-Anschlusspunkte in allen Projektionen definiert sind. Das Makro führt den Prozess automatisch fort. Für jede Bilddatei wird eine neue Datei mit den Standardnamen ROI erstellt, gefolgt vom ursprünglichen Bildnamen.

Um die NMJ-Merkmale zu quantifizieren, gehen Sie zunächst zur Drosophila NMJ Morphometrics-Schnittstelle und stellen Sie die Skala ein. Wenn ein Pixel im Bild z. B. 0,72 Mikrometern entspricht, legen Sie die Skalierungspixel auf eins und den Skalierungsabstand auf 0,072 fest. Wählen Sie dann das Untermakro analyze aus und wenn es zwei Kanalbilder gibt, schalten Sie auch die Gewichtung um.

Drücken Sie OK und wählen Sie bei Aufforderung das Verzeichnis der Bilddatei aus. Die Verarbeitungszeit kann mehrere Minuten pro Synapse betragen. Nach der Analyse werden neue Bilddateien für jede analysierte Synapse im Elternordner gespeichert und die quantitativen Messungen sind die Ergebnisse.

txt-Datei. Überprüfen Sie alle Bilder und schließen Sie Bilder mit Segmentierungsfehlern aus. Zum Beispiel könnten Teile des synaptischen Terminals nicht in der gelben Umrandung enthalten sein.

Teile des Hintergrunds können im synaptischen Terminal enthalten sein. Eine blaue Skelettlinie kann sich über das synaptische Terminal hinaus erstrecken. Möglicherweise gibt es zu viele aktive Zonen, oder einige aktive Zonen bleiben unerkannt.

Wenn mehr als 5% der Bilder Segmentierungsfehler aufweisen, sollten Sie verschiedene Analysealgorithmen ausprobieren, um die Bildverarbeitung zu verbessern. In den folgenden Videoabschnitten wird beschrieben, wie Sie viele dieser Makroanalyseeinstellungen definieren. Um den Wert für den Rollradius der Kugel für das Makro anzupassen, wählen Sie drei NMJ Z-Projektionen aus, die für den Bilddatensatz repräsentativ sind.

Löschen Sie den Namen des Bildes mit der Ergebnisauflösung und den Namen des Stapelbilds für zwei aktive Zonen, die zuvor vom Untermakro analyze erstellt wurden. Öffnen Sie die Stapelbild-Namensdateien für jedes ausgewählte Bild, und wählen Sie dann in der Symbolleiste geteilte Kanäle aus, um ein Bild von Kanal eins und ein Bild von Kanal zwei zu erstellen und diese Dateien zu speichern. Öffnen Sie das Bild des Kanals eins, das in diesem Fall der Immunmarkierung von DLG one entspricht.

Führen Sie nun den Filter subtract background aus, der sich auf der Registerkarte process befindet. Legen Sie den Radius der rollenden Kugel auf einen Wert fest, der den Kontrast zwischen Synapse und Hintergrund erhöht. Erstellen Sie eine Z-Projektion mit dem Projektionstyp "Maximale Intensität" und speichern Sie das Bild.

Führen Sie dann den Algorithmus zum Subtrahieren des Hintergrunds mit dem neuen Radius der rollenden Kugel für alle Z-Projektionen aus, und speichern Sie die Ergebnisse. Um die besten automatischen Schwellenwerte für das Makro zu ermitteln, öffnen Sie die gespeicherten C-Projektionen, und führen Sie den automatischen Schwellenwert mit der Option Alle ausprobieren aus. Suchen Sie aus den resultierenden Bildern den am besten geeigneten Algorithmus für die Bilder und fahren Sie mit dieser Schwellenwerteinstellung fort, wenn Sie das Makro für weitere Bilder ausführen.

Die Definition der verschiedenen automatischen Schwellenwerte ist entscheidend für die korrekte Bildsegmentierung durch das Makro. Aus diesem Grund ist es wichtig, acht der Signage-Parameter richtig zu quantifizieren, daher ist es wichtig, mit den 16 von der Software angebotenen Optionen für den automatischen Schwellenwert vertraut zu sein. Drücken Sie die Plus-Taste, um in das Ergebnisbild des automatischen Schwellenwerts zu zoomen.

Die Algorithmusnamen befinden sich unter jedem Ergebnisbild. In diesem Beispiel ist Huang der beste Algorithmus für den automatischen Schwellenwert zum Festlegen des NMJ-Gliederungsschwellenwerts. Für den Skelettschwellenwert ist die beste Einstellung Li, und die beste Einstellung für den Schwellenwert der aktiven Zone ist Huang.

Um die feinen Maxima Rauschtoleranz für das Makro zu definieren, kehren Sie zu den ursprünglichen repräsentativen NMJ-Bildern zurück. Öffnen Sie den BRP-Kanal. Gehen Sie im Popup-Menü auf die Registerkarte Plugins und wählen Sie maximales 3D.

Nach kurzer Zeit erscheint ein neues Bild, dann schließen Sie das Originalbild. Verwenden Sie als Nächstes den minimalen 3D-Befehl. Schließen Sie dann das Maximum von C2-Stacks, synapse ein Image, und wählen Sie das neu erstellte Image-Minimum von maximal C2 Stack synapse one aus.

Verwenden Sie nun den Befehl find maxima. Wählen Sie im neuen Fenster die Auswahl des Vorschaupunkts und stellen Sie die Rauschtoleranz auf 50 ein. Die Maxima-Punkte werden dann mit kleinen Kreuzen angegeben, die nur die aktiven Synapsenzonen abdecken sollten.

Wenn zu viele Kreuze gemacht werden, erhöhen Sie den Wert für die Geräuschtoleranz. Wenn einige der aktiven Zonen nicht mit Anmerkungen versehen sind, verringern Sie den Wert für die Rauschtoleranz. Verwenden Sie den abgeleiteten Schwellenwert für das Feld "Maximale Rauschtoleranz suchen" des Makros.

Bei der Auswahl des maximalen Rauschtoleranzwerts ist es wichtig, die Anzahl der aktiven Zonen richtig zu quantifizieren. Manchmal ist es notwendig, verschiedene Werte auszuprobieren, um den richtigen zu definieren. Passen Sie nun alle abgeleiteten Werte in den Schwellenwertalgorithmen in der Makroschnittstelle an und führen Sie die Untermakroanalyse für die repräsentativen Bilder aus, die ursprünglich zur Definition der Makroeinstellungen verwendet wurden.

Es wird eine neue Datei mit den aktiven Zonen erstellt, die durch weiße Punkte gekennzeichnet sind. Öffnen Sie diese Datei, indem Sie sie per Drag & Drop in die Symbolleiste ziehen und Z-Projekt mit einem Projektionstyp als einige Slices auswählen. Somit wird eine Projektionsdatei erstellt.

Der nächste Schritt besteht darin, den Schwellenwert anzupassen. Schieben Sie im neuen Schwellenwertfenster die obere Leiste, um einen Schwellenwert auszuwählen, bei dem alle gewünschten Brennpunkte gelesen werden. Dies sind die positiven Punkte von BRP.

Verwenden Sie diesen Wert als unterer Schwellenwert für BRP-Puncta. Führen Sie nun die Analyse für die ursprünglichen repräsentativen NMJ-Bilder mit den zuvor definierten Werten, Algorithmen und dem neuen unteren Schwellenwert für BRP-Puncta erneut aus. Die resultierenden Bilder sollten die Kriterien für eine kritische Analyse erfüllen.

Verwenden Sie nun die definierten Einstellungen, um das Makro auf alle NMJ-Bilder auszuführen, die unter den gleichen Bedingungen erhalten wurden. Das Drosophila NMJ Morphometrie-Makro wurde verwendet, um verschiedene bekannte synaptische Defekte in drei mutierten Genotypen zu validieren. Es ist bekannt, dass zwei Mutanten von Ankyrin fusionierte Boutons und kleinere NMJs haben.

Mit Hilfe des Makros wurden die Fläche und der Umfang von Panuronil und Quirin zwei RNAI-Knock-down-NMJs gemessen und es wurde festgestellt, dass sie signifikant kleiner sind als bei Kontrollen. Die GTPase Rab3 wird für die korrekte Verteilung der Bruckpila benötigt. Wenn es gestört wird, gibt es weniger aktive Zonen.

Mit dem Makro Panuronil Rab 3 hatten Knock-Down-Fliegen durchschnittlich 138 aktive Zonen pro NMJ-Terminal, verglichen mit 290 bei Kontrollen. Hochdraht ist ein wichtiger Regulator des NMJ-Wachstums und wenn sie mutiert sind, haben NMJs ausgedehnte Verzweigungen an ihren Enden. Unter Verwendung des Makro-Panuronil-Hochdraht-RNAI-Knock-Down-Lines zeigten signifikante Erhöhungen mehrerer vom Skelett abgeleiteter Parameter an ihren NMJs, einschließlich der Gesamtlänge, der längsten Astlänge, der Anzahl der Äste und der Anzahl der Verzweigungspunkte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Morphometrie-Makro Drosophila NMJ bedienen und die Einstellungen anpassen. Einmal gemeistert, kann die Analyse von 50 Synapsen innerhalb einer Stunde durchgeführt werden. Dies spart etwa 15 Minuten Quantifizierungszeit pro Synapse.

Es ist wichtig, Bilder von guter Qualität des NMJ zu erhalten. Je besser die Bilder, desto besser ist die Leistung des Makros. Diese Technik wird Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie helfen, morphologische Parameter des Drosophila NMJ effizient zu quantifizieren.