Verwendung von In-vitro- Live Cell Imaging zur Erkundung Chemotherapeutika geliefert durch Lipid-basierte Nanopartikel

Das übergeordnete Ziel dieser Live-Cell-Bildgebungstechnik besteht darin, zelluläre Prozesse wie die Aufnahme und Verteilung von Chemotherapeutika ohne die Notwendigkeit einer Fixierung zu verfolgen. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise: Wie nehmen Tumorzellen Chemotherapeutika – entweder in freier Form oder verkapselt in Nanopartikeln – auf? Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass lebende Zellen abgebildet werden, wodurch Fixierungsartefakte vermieden und eine dynamische Echtzeitauswertung ermöglicht wird.

Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir beobachteten, dass Nanopartikel während der Fixierung zerfielen, was zu Fehlinterpretationen der Arzneimittelabgabe führte. Um die Abbildungskammer zusammenzubauen, platzieren Sie ein 25 Millimeter großes Deckglas im unteren Teil der Kammer und schrauben den oberen Teil in den unteren Teil ein. Ziehen Sie nicht zu fest an, da das Glas zerbrechen kann.

Autoklavieren Sie die gesamte Kammer. Um die Zellen zu plattieren, nehmen Sie die Bildgebungskammer in einem Laminar-Flow-Arbeitsplatz aus der Sterilisationsverpackung. Ziehen Sie die Kammer vorsichtig fest und stellen Sie sie in eine Petrischale.

Beschichten Sie das Glas der Imaging-Kammer mit einem Milliliter 0,1-prozentigem sterilen Gelatin für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Nach dem Entfernen des Mediums aus den Zellkultur-Flaschen waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS und lösen die Zellen mit 0,25-prozentigem Trypsin ab. Inaktivieren Sie das Trypsin durch Zugabe von Zellkultur-Medium.

Anschließend sammeln Sie die Zellen ein und zentrifugieren sie fünf Minuten lang mit 1.100 ×g. Resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Milliliter Zellkulturmedium. Nach der Zellzählung gemäß der im Textprotokoll beschriebenen Methode saugen Sie das Gelatin ab und pipettieren die Zellen in einer Verdünnung, die innerhalb von 24 Stunden eine maximale Bedeckung von 70 Prozent ermöglicht.

Lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang bei fünf Prozent Kohlendioxid und 37 Grad Celsius andocken. Führen Sie eine Beurteilung der Zellen unter dem Mikroskop hinsichtlich Konfluenz, zellulärer Morphologie und Kontamination durch. Schalten Sie anschließend das Konfokalmikroskop, das Fluoreszenzlicht und den Computer ein.

Verbinden Sie die Objektivheizung mit dem Objektiv und stellen Sie sie auf 35 Grad ein. Bereiten Sie die Inkubationseinheit gemäß dem schriftlichen Protokoll vor. Stellen Sie die Inkubationseinheit auf den Mikroskopständer und verbinden Sie die CO₂-Zu- und -Ablaufschläuche.

Öffnen Sie das Hauptventil für Kohlendioxid und schalten Sie den Kohlendioxid-Regler ein. Überprüfen Sie, ob der Regler auf fünf Prozent Kohlendioxid eingestellt ist. Richtige Zellkulturbedingungen wie Temperatur, CO2, pH, Luftfeuchtigkeit und Sterilität sind entscheidend für die langfristige Zellbildgebung.

Daher muss jeder Inkubator ordnungsgemäß geprüft werden. Stellen Sie die Plattformtemperatur auf 37 Grad Celsius ein. Lassen Sie die Inkubationseinheit die gewählte Temperatur und den Kohlendioxidanteil erreichen.

Nehmen Sie die Abildungskammer aus dem Haupt-CO₂-Inkubator und transportieren Sie die Kammer in einer Petrischale in den Mikroskopieraum. Stellen Sie die Abildungskammer in einen speziell angefertigten Objekthalter mit 35 Millimeter Durchmesser und verschließen Sie die Kammer mit einem speziell angefertigten Deckel. Öffnen Sie die Inkubationseinheit und ersetzen Sie so schnell wie möglich, um eine Abkühlung der Zellen zu vermeiden, das rote Patch durch die Abildungskammer und schließen Sie danach die Einheit.

Stellen Sie sicher, dass sich keine Kabel zwischen Objekttisch und Mikroskop befinden. Lassen Sie das Gerät 30 Minuten lang akklimatisieren. Öffnen Sie anschließend die Software und schalten Sie den Laser ein.

Erstellen Sie eine neue Datenbank, indem Sie unter der Registerkarte „Datei“ auf „Neu“ klicken. Benennen und speichern Sie die Datenbank. Legen Sie die Konfiguration fest, indem Sie unter der Registerkarte „Erfassen“ auf „Konfigurieren“ klicken.

Wählen Sie „Kanalmodus“ und „Einzelner Kanal“, um einen einzelnen Fluorophor zu bewerten. Wählen Sie „Mehrfacher Kanal“ für mehrere Fluorophore. Anschließend wählen Sie die geeigneten Bandpassfilter entsprechend dem Fluorophor aus.

Wählen Sie den Hellfeldkanal in einer der Spuren aus. Die Aufnahme wird durch die Fluoreszenzsignale der Verbindungen und die Bildqualität beeinträchtigt. Überbelichtung, Photobleaching, Signal-Rausch-Verhältnis, die Qualität der Zellen sowie die zugesetzten Verbindungen sind Faktoren, die die Ergebnisse beeinflussen können und sorgfältig getestet werden müssen.

Stellen Sie die Scan-Steuerung ein, indem Sie unter der Registerkarte „Acquire“ auf „Scan“ klicken. Klicken Sie anschließend auf „Mode“, um die Bildgröße, die Scan-Geschwindigkeit, die Scan-Richtung und die Scan-Durchschnittsbildung festzulegen. Klicken Sie auf „Channels“, um die Blende, die Verstärkung und den Offset sowie die Laserleistung einzustellen.

Speichern Sie diese Einstellungen, indem Sie im Reiter „Configuration“ auf „Config“ klicken, und speichern Sie sie in der Konfigurationsdatenbank. Stellen Sie die Zeitrafferfunktion ein, indem Sie im Reiter „Macro“ auf „Muti TimeX“ klicken. Klicken Sie auf „Single Location“.

Wenden Sie die gespeicherte Konfiguration an, indem Sie auf Einzelne Spur klicken, und blättern Sie in der Konfigurationsdatenbank zur erforderlichen Konfiguration. Stellen Sie das Zeitintervall und die Anzahl der Scans ein. Laden Sie die Konfiguration, indem Sie auf Konfig. laden klicken.

Benennen Sie die Zeitrafferaufnahme im Feld Basis-Dateiname und wählen Sie die Datenbank aus, indem Sie auf „Image Data Base“ klicken, um die Zeitrafferaufnahme zu speichern. Legen Sie einen temporären Ordner fest, indem Sie auf „Temporary Image Folder“ klicken. Öffnen Sie danach die Inkubationseinheit, heben Sie den Bildgebungsring an, geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv und schließen Sie die Einheit so schnell wie möglich. Fokussieren Sie und wählen Sie eine Position in der Bildgebungskammer aus.

Verdünnen Sie im laminaren Luftstromschrank das freie Medikament oder die Nanopartikel in einer Konzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter Medikament beziehungsweise 0,05 Mikromol Lipide in Zellkultur-Medium. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter, falls das Medikament oder die Nanopartikel nicht steril sind. Öffnen Sie die Inkubationskammer und heben Sie die Deckelabdeckung an.

Entfernen Sie anschließend das Medium von den Zellen, geben Sie ein Milliliter verdünntes Medikament oder Nanopartikel hinzu und schließen Sie die Einheit so schnell wie möglich. Fokussieren Sie die Zellen und führen Sie eine schnelle Aufnahme durch Klicken auf „Einzel“ im Reiter Scan-Steuerung durch. Sobald im Hellfeldbild scharf fokussierte Zellen zu sehen sind, starten Sie die Zeitrafferaufnahme durch Klicken auf „Zeit starten“ im Multi-TimeX-Makro.

Die Anzahl der Wiederholungen und die verbleibende Zeit werden im Makro und in den Bildern angezeigt. Überprüfen Sie regelmäßig, ob die Zellen noch scharf gestellt sind, oder verwenden Sie die automatische Fokussierung. Das Programm speichert die Zeitrafferaufnahme automatisch in der Datenbank.

Die Datenbank darf nicht geschlossen werden, während das Programm läuft. Dies ist eine dreistündige Zeitrafferaufnahme von Zellen, die freiem Doxorubicin ausgesetzt waren. Beobachten Sie die Aufnahme und die sofortige Translokation des rot fluoreszierenden Doxorubicin in den Zellkern.

Hier werden die Zellen drei Stunden lang mit verkapseltem Doxorubicin inkubiert. Das fluoreszierende Signal ist deutlich schwächer und befindet sich im Zytoplasma. Im Zellkern ist das Signal kaum sichtbar.

Wenn diese Zeitraffervideos in Image J übertragen werden, kann ein interessierender Bereich um den Zellkern gezeichnet und die Pixeldichte gemessen werden. Der hier gezeigte Graph veranschaulicht den Unterschied in der nukleären Aufnahme über die Zeit in Zellen, die entweder mit freiem oder verkapseltem Doxorubicin inkubiert wurden. Dargestellt sind hier Zellen, die mit verkapseltem Doxorubicin (in Rot dargestellt) inkubiert wurden.

Das violette Signal stellt den Träger dar und Lysosomen sind mit einem grünen Marker für lebende Zellen angefärbt. Der Vergleich beider Zelltypen zeigt einen Unterschied in der lysosomalen Verteilung. Lysosomen in B16BL6-Zellen sind im gesamten Zytoplasma verteilt.

Hingegen befinden sich die Lysosomen in BLM-Zellen in der Nähe des Zellkerns. Beide Zelllinien weisen jedoch eine hohe Kolokalisation des roten und violetten Signals in den Lysosomen auf, was darauf hinweist, dass Doxorubicin und sein Trägersystem in diesen Organellen festgehalten werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Aufnahme chemotherapeutischer Wirkstoffe und anderer fluoreszierender Marker in lebende Zellen über mehrere Stunden oder sogar Tage hinweg bildlich dargestellt werden kann.