Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Zellviabilität in einer Kultur von Kleinhirn-Granulaneuronen genau zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften und Neuropharmakologie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir unerwünschte Gliazellen von Neuronen in MISTA-Zellkulturen unterscheiden können.

Die Verfahren werden von Lin Jiajia, Wang Jialing und Xu Dilin demonstriert, drei Bachelorstudenten aus meinem Labor. Beginnen Sie mit der Dissektion der Köpfe acht Tage alter Rattenwelpen, indem Sie die Schere zuerst in das Foramen magnum einführen und die beiden Seiten des Schädels von den Ohren bis zu den Augen aufschneiden. Heben Sie dann mithilfe einer Pinzette den Schädel an.

Verwenden Sie eine Pinzette, um das Kleinhirn zu isolieren, und legen Sie es in eine 35-Millimeter-Schale, die Dissektionslösung enthält. Überführen Sie die Schale auf den Tisch des Stereomikroskops und entfernen Sie mit zwei Paar Pinzetten die Hirnhäute und Blutgefäße. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Klinge und überführen Sie es anschließend in ein Zentrifugenröhrchen, das 30 Milliliter Dissektionslösung enthält.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur bei 1.500 × g. Nach der Zentrifugation den Überstand abpipettieren und das Pellet aufbewahren. Danach Trypsin-Lösung zum Pellet hinzufügen und durch vorsichtiges Schütteln resuspendieren.

Anschließend das Gefäß 15 Minuten lang in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius stellen. Nach 15 Minuten eine Lösung aus DNase One, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor und Magnesiumsulfat hinzufügen und schütteln. Danach fünf Minuten bei Raumtemperatur bei 1.500 × g zentrifugieren.

Nachdem der Überstand abgesaugt wurde, resuspendieren Sie das Pellet in einer weniger verdünnten DNase-One-, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor- und Magnesiumsulfatlösung. Bereiten Sie anschließend zwei 15-Milliliter-Röhrchen vor. Geben Sie die Hälfte der Zellen in jedes Röhrchen und pipettieren Sie beide 60 bis 70 Mal mit einer mit Watte verschlossenen Pasteurpipette auf und ab, um die Zellen zu homogenisieren.

Nach der Homogenisierung drei Milliliter Magnesiumsulfat- und Calciumchloridlösung zu jedem 15-Milliliter-Röhrchen hinzufügen. Die Röhrchen 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Sobald die Zeit abgelaufen ist, vorsichtig den Überstand mit einer mit Baumwolle verstopften Pasteur-Pipette entfernen und in neue 15-Milliliter-Röhrchen überführen.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur und 1.500 × g. Geben Sie Kulturmedium zum Pellet, um eine Zelldichte von etwa 1,5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter einzustellen. Pipettieren Sie die Zellen in eine 6-Well-Platte und kultivieren Sie sie im Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.

Nach 24 Stunden AraC-Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzufügen, um das Wachstum der Gliazellen zu hemmen, bevor die Platten in den Inkubator zurückgebracht werden. An Tag sieben dann 50 Mikroliter D-Glucose-Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzufügen. Beginnen Sie die Färbung, indem Sie Fluoresceindiacetat bis zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter und Propidiumiodid bis zu einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter in 10 Milliliter PBS mischen.

Mischen Sie die FDA/PI-Lösung durch Vortexen und stellen Sie sie auf Eis. Stellen Sie die Kulturplatte auf Eis. Aspirieren Sie vorsichtig das Kulturmedium, ohne die Zellen mit der Pipettenspitze zu berühren, und geben Sie dann langsam kaltes PBS hinzu.

Entfernen Sie das PBS, dann fügen Sie kalte FDA/PI- oder FDA/PI/Hoechst-Arbeitslösung hinzu. Stellen Sie die Platte fünf Minuten lang auf Eis. Anschließend, nach dem Absaugen der FDA/PI- oder FDA/PI/Hoechst-Arbeitslösung, geben Sie kaltes PBS in jede Vertiefung.

Stellen Sie sicher, dass das Fluoreszenzmikroskop korrekt eingerichtet ist. Detektieren Sie die Fluoreszenzemissionen für FDA, PI und Hoechst bei 520, 620 bzw. 460 Nanometern mit einer Belichtungszeit zwischen 100 und 300 Millisekunden und einer analogen Verstärkung von 2,8 x. Nach der Aufnahme der Fluoreszenzbilder nehmen Sie ein Bild im normalen Licht mithilfe des Phasenkontrastmodus auf.

Bei der Doppelfärbung mit FDA/PI überlagern Sie die Zellbilder, indem Sie in der Grafiksoftware die FDA-positive Ebene auf die PI-positive Ebene ziehen. Passen Sie die Deckkraft der FDA-positiven Ebene an, indem Sie im Feld „Deckkraft“ des Ebenenbedienfelds 50 % eingeben. Führen Sie die beiden Ebenen zusammen, indem Sie das Ebenenmenü öffnen und auf die Schaltfläche „Sichtbare Ebenen verbinden“ klicken.

Stellen Sie den Kontrast der Überlagerungsbilder ein, indem Sie im Bereich Bild, Anpassungen, Helligkeit/Kontrast im Feld Kontrast den Wert 50 eingeben. Überprüfen Sie, ob keine FDA- und PI-doppelt positiven Zellen in den Überlagerungsbildern vorhanden sind. Für die FDA/PI/Hoechst-Dreifachfärbung überlagern Sie die Bilder der Zellen erneut, indem Sie die FDA-positive Schicht erneut auf die PI-positive Schicht ziehen, die Deckkraft der FDA-positiven Schicht anpassen und die Bilder wie zuvor zusammenführen.

Ziehen Sie dann die Hoechst-positive Ebene auf die zusammengeführte Ebene. Passen Sie die Deckkraft der Hoechst-positiven Ebene an, indem Sie im Feld „Opacity“ des Ebenenpanels 50 % eingeben, und verschmelzen Sie die beiden Ebenen, indem Sie das Ebenenmenü öffnen und auf die Schaltfläche „Merge Visible“ klicken. Unterscheiden Sie visuell große, unregelmäßige Gliazellen von zerebellaren Granulaneuronen, indem Sie die im Fluoreszenzmodus aufgenommenen Bilder mit denen im Phasenkontrastmodus vergleichen.

Die folgenden Bilder zeigen, dass sowohl kleine Neuronen als auch große, unregelmäßige Gliazellen in der CGN-Kultur vorhanden sind. Dieses Bild zeigt die Aminofärbung von GAP-43 in einer CGN-Kultur nach acht Tagen in vitro. Die blauen Pfeile weisen auf Neuronen hin.

Hier ist die GFAP-Aminofärbung von Gliazellen dargestellt. Der weiße Pfeil zeigt eine Gliazelle an. Diese Phasenkontrastaufnahme zeigt die Morphologie der Zellen.

Die FDA/PI-Hakenfärbung, die Gliazellen von Neuronen unterscheiden kann, ist vorteilhaft für die genaue Beurteilung der neuronale Vitalität in CGN-Kulturen. Dies ist ein zusammengefügtes Bild von dreifach gefärbten Zellen, die in normalem Wachstumsmedium gezüchtet wurden. Der Pfeil zeigt eine typische Gliazelle.

Hier wurde eine ähnliche Kultur mit Medium mit niedrigem Kaliumgehalt behandelt, und der Pfeil zeigt erneut eine typische Gliazelle. Beachten Sie auch das Auftreten der roten Propidiumiodid-Färbung. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden.

Eine ähnliche Strategie kann auf andere gemischte Zellkulturen, wie primäre kortikale Kulturen und primäre hippokampale Kulturen, angewendet werden, um die neuronale Vitalität genau zu analysieren.