Die DNA-Farbstoff-ausgelöste Seitenbevölkerung Phänotyp zur Erkennung und Reinigung von Krebsstammzellen aus biologischen Proben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mögliche Krebsstammzellpopulationen in biologischen Proben basierend auf der Farbstoffausscheidungskapazität der Side-Population-Zellen nachzuweisen. Diese Methode befasst sich mit einer zentralen Fragestellung der Krebsstammzellenforschung, nämlich zuverlässige Methoden zur Detektion und Anreicherung von Krebsstammzellen aus biologischen Proben bereitzustellen. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass funktionelle Marker verwendet werden, wodurch eine bessere Auflösung erzielt wird.

Außerdem ist die Expression dieser ABC-Drug-Transporter unter Krebsstammzellen stark konserviert, weshalb wir diese Technik für zahlreiche verschiedene Krebserkrankungen nutzen können. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Entdeckung von Therapeutika gegen Krebsstammzellen, da sie downstream-Analysen wie die Profilierung der Genexpression und die Validierung von Zielstrukturen in hochreinen Krebszellen ermöglicht. Diese Methode kann daher Einblicke in die Eigenschaften von Krebsstammzellen liefern.

Wir können diese Methode auch verwenden, um Systeme zu charakterisieren, die aus Populationen mit exprimierenden ABC-Arzneimitteltransportern bestehen, wie beispielsweise das Knochenmark. Die Durchführung der Prozedur demonstriert Elisabeth Hoflehner, eine Technikerin aus meinem Labor. Beginnen Sie damit, die gewünschte humane Krebszelllinie bei 37 Grad Celsius in 10 bis 30 Milliliter RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10 % FBS, zwei Millimolar L-Glutamin und Antibiotika, zu kultivieren.

Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 70 bis 90 % erreicht haben, entfernen Sie das Medium und geben zwei Milliliter 0,05 %iges Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellen von der Oberfläche der Kulturschale zu lösen. Anschließend waschen Sie die Zellen mit 10 Milliliter Kulturmedium, überführen die Suspension in ein sauberes 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren sie bei 250 × g und vier Grad Celsius fünf Minuten lang. Sobald die Zellen pelletiert sind, entfernen Sie das Überstand und resuspendieren das Pellet in einem Milliliter Kulturmedium.

Eine kleine Aliquot der Zellsuspension mit Trypanblau-Lösung mischen und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Für die Herstellung der Testproben die Zellen in frischem Kulturmedium suspendieren, um eine Zellsuspension mit einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter zu erhalten. Nach der Einstellung der Zelldichte drei Milliliter der Probe in ein 15-Milliliter-Rundbodenglasröhrchen überführen, das als Test beschriftet ist.

Dann 10 µM violetten Farbstoff zur Probe hinzufügen und die Suspension vorsichtig wirbeln. Als Nächstes Hemmkontrollen herstellen, indem 500 µL der Farbstoff enthaltenden Zellsuspension in zwei als Kontrolle beschriftete Durchflusszytometrieröhrchen überführt werden. 50 µM Verapamil zum ersten hinzufügen.

Und 20 µM Fumitremorgin C zur zweiten Röhre hinzufügen. Die Lösungen durch vorsichtiges Pipettieren mischen. Alle Röhren mit Verschlusskappen verschließen und 90 Minuten bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.

Die Proben alle 15 Minuten vorsichtig schwenken. Nach Abschluss der Färbung die Inhibierungs-Kontrollen mit drei bis vier Milliliter eiskaltem PBS waschen. Anschließend Aliquots der Testprobe für eine nachfolgende Ko-Färbung mit Antikörpern vorbereiten.

Spülen Sie diese Aliquots ebenfalls und filtrieren Sie alle Proben durch 70-Mikron-Filter, um potenzielle Zellaggregate zu entfernen. Anschließend zentrifugieren Sie die Suspensionen bei 250 × g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Nach dem erneuten Aufschwemmen des resultierenden Pellets in 100 Mikrolitern PBS bewahren Sie die Zellen geschützt vor Licht auf Eis auf.

Fügen Sie anschließend eine geeignete Antikörper-Panels mit Fluorchrom-Konjugaten zu den Zellen hinzu, die zuvor mit violettem Farbstoff vorgefärbt wurden. Vortexen Sie die Suspensionen und inkubieren Sie sie 20 bis 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen mit drei bis vier Milliliter eiskaltem PBS, filtrieren Sie die Probe gegebenenfalls.

Anschließend bei 250 × g bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugieren. Das Überstandsvolumen verwerfen und die pelletierten Zellen in 100 µL PBS resuspendieren. Schließlich 7-AAD zu den mit violettem Farbstoff vorbehandelten Zellen hinzufügen.

Anschießend die Proben fünf bis 10 Minuten im Dunkeln inkubieren. Um die Zellen mittels Durchflusszytometer zu analysieren, eine geeignete Zellpopulation im FSC-SSC-Dot-Plot auswählen. Anschließend mittels unterschiedlicher FSC-Signale alle Zellaggregate aus der ausgewählten Population ausschließen.

Schließen Sie Zellen, die eine positive 7-AAD-Färbung aufweisen, aus, um die Population lebensfähiger Zellen zu erhalten. Um ein Punktdiagramm für die Emission der blauen und roten Farbstoffe zu erstellen, zeigen Sie den blauen fluoreszierenden Kanal auf der y-Achse und den roten fluoreszierenden Kanal auf der x-Achse an. Schalten Sie beide Kanäle in den linearen Modus und stellen Sie die Detektorspannung entsprechend ein, sodass die Seitenpopulation im unteren linken Bereich des Diagramms liegt.

Danach die Side-Population auswählen und die Datenaufnahme stoppen. Anschließend die Hemmkontrollen laden und die Daten aufnehmen.

Erstellen Sie abschließend ein Punktdiagramm, das die rote Fluoreszenz des violetten Farbstoffs auf der x-Achse und einen geeigneten Fluoreszenzkanal auf der y-Achse im logarithmischen Modus darstellt. Laden Sie die Probe, stellen Sie die Detektorspannungen entsprechend ein und identifizieren Sie den Anteil der Side-Population-Zellen, die die untersuchte Oberfläche exprimieren. Nehmen Sie anschließend die Daten auf.

Hier werden repräsentative Ergebnisse der Side-Population-Analyse an menschlichen Ovarialkarzinomzellen vorgestellt. Die durch die Analyse der blauen und rot-violetten Emission identifizierte Side Population befand sich im linken unteren Quadranten des Punktdiagramms und machte 0,70 % der gesamten analysierten Zellpopulation aus. Die anschließende Verwendung von Effluxhemmstoffen führte zum Verschwinden des Fluoreszenzsignals, das zuvor für diese Zellen beobachtet wurde, und bestätigte damit ihr Side-Population-Phänotyp.

Schließlich wurden die humanen ovariellen Zellen auch hinsichtlich der ABCG2-Expression charakterisiert. Eine ABCG2-positive Färbung wurde in 0,67 % der Zellen beobachtet, die der identifizierten Side-Population entsprechen. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa zwei bis drei Stunden durchgeführt werden.

Bei Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass das Side-Population-Phänotyp streng von einem optimalen Verhältnis zwischen Farbstoffkonzentration und Zelldichte abhängt. Eine sorgfältige Abstimmung beider Variablen wird daher vor dem Experiment dringend empfohlen. Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Genexpressionsanalyse angewendet werden, um die Side-Population-Zellen weiter zu charakterisieren und somit neue, spezifische Zielstrukturen an Krebsstammzellen für die zukünftige Arzneimittelentwicklung zu identifizieren.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der Stammzellbiologie, um die Eigenschaften von Gewebestammzellen und Krebsstammzellen sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den violett gefärbten, ausgelösten Side-Population-Screening-Assay durchführt und wie man putative Krebsstammzellen in biologischen Proben in Ihrem eigenen Labor nachweist. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischen Proben äußerst gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von PSA und biologischen Sicherheitswerkbänken bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.