Herzmuskelzellbasierter Aktuator und selbststabilisierender Biorobot - TEIL 1

Das übergeordnete Ziel dieses Videos besteht darin, die Entwicklung und Charakterisierung eines biologischen Aktuators mithilfe flexibler PDMS-Konsolbalken in Kardiomyozyten zu beschreiben. Diese Aktuatoren werden anschließend mit einer modifizierten Basis kombiniert, um einen selbststabilisierenden schwimmenden Bioroboter zu bilden. Die hier beschriebene Verifizierungsmethode ist einzigartig, da die mechanische Grundstruktur so modifiziert wird, dass ein selbststabilisierender schwimmender Bioroboter entsteht, dessen Position zusätzlich extern mittels Magneten bestimmt werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Basiseigenschaften leicht verändert werden können, um die Auftriebskraft des Geräts anzupassen und eine Selbststabilisierung zu ermöglichen. Die Methode kann zur Entwicklung anderer neuartiger Geräte eingesetzt werden, die Selbststabilisierung und Schwimmfähigkeit erfordern. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die mechanische Verformung der Ausleger herausfordernd ist.

Wegen ihrer geringen Dicke können sie leicht reißen oder in ungewöhnliche Formen verknittern. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte und die Montage ohne visuelle Unterstützung nur schwer zu erlernen sind. Beginnen Sie damit, eine Siliziumscheibe auf einen Fotolack-Spinner zu legen.

Tragen Sie einen dünnen Fotolack auf den Wafer auf und beschichten Sie ihn durch Schleudern bei 2.000 U/min für 20 Sekunden, um eine Sollschichtdicke von 1,2 Mikrometern zu erreichen. Überführen Sie anschließend den beschichteten Wafer mit Wafer-Pinzetten auf eine auf 120 Grad Celsius vorgeheizte Heizplatte. Decken Sie den Wafer mit einer flachen Petrischale ab und trocknen Sie ihn 10 Minuten lang ein.

Wiegen Sie sechs Gramm einer PDMS-Grundmasse ab und mischen Sie sie mit 0,6 Gramm eines PDMS-Härters. Vermengen Sie die PDMS-Bestandteile gründlich für fünf Minuten. Geben Sie das PDMS-Gemisch in eine Vakuumkammer und ziehen Sie 30 Minuten lang ein Vakuum von 100 Millibar.

Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, brechen Sie das Vakuum ab und entfernen Sie den Behälter. Halten Sie den Behälter bedeckt, bis das PDMS benötigt wird. Sobald der Wafer abgekühlt ist, legen Sie ihn erneut auf den Fotolack-Spinner.

Gießen Sie die gesamte entgaste PDMS-Mischung langsam auf das Wafer, sodass keine neuen Blasen entstehen. Beschichten Sie dann das Wafer mit einer Schleuderbeschichtung bei 1.200 U/min für fünf Minuten. Entfernen Sie das Wafer mit Wafer-Pinzetten aus dem Schleuderbeschichter und legen Sie es in einen vorgeheizten Ofen.

Den Wafer über Nacht backen und anschließend auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Danach einen Lasergravierer vorbereiten, um die dünne PDMS-Schicht zu strukturieren. Schalten Sie zunächst den Lasergravierer und dessen Absauganlage ein.

Schalten Sie dann den mit der Lasergravurmaschine verbundenen Computer ein und öffnen Sie die Software der Lasergravurmaschine. Öffnen Sie unter Datei die Konstruktionsdatei des biologischen Aktuators. Drücken Sie die Schaltfläche Einstellungen, klicken Sie auf Blau und ändern Sie die Leistung auf 3 % und die Geschwindigkeit auf 4 %. Klicken Sie auf Übernehmen, klicken Sie auf Rot und ändern Sie den Modus auf Überspringen.

Klicken Sie dann auf „Setzen“. Wiederholen Sie dies für Schwarz. Drücken Sie die Schaltfläche „Übernehmen“, um die Einstellungen abzuschließen.

Als Nächstes wählen Sie „Engraver aktivieren“. Drücken Sie dann auf „Umsiedeln“, um das Design in die Mitte des Bildschirms zu verschieben. Danach drücken Sie die Schaltfläche „Ansicht fokussieren“ und klicken auf den Rand des Designs, um den führenden Laserpunkt zu dem entsprechenden Punkt zu bewegen.

Richten Sie die Wafer mit Hilfe des führenden Laserpunkts vorsichtig mit behandschuhten Händen aus. Sobald die Ausrichtung abgeschlossen ist, wählen Sie „Gravur des vorherigen Auftrags starten“, um den Gravurvorgang zu beginnen. Zur Herstellung der Basis des biologischen Aktuators wird ein Behälter zum Backen benötigt.

Stellen Sie zunächst den Behälter auf eine Waage und tariern Sie die Waage. Gießen Sie dann vorgemischtes PDMS ein und platzieren Sie gereinigte Glaskugeln mit einem Durchmesser von 3 Millimetern in regelmäßigen Abständen auf die PDMS-Mischung. Lassen Sie um jede Kugel herum mindestens 5 Millimeter Platz für die Basis des biologischen Aktors.

Stellen Sie den Behälter in eine Vakuumkammer, reduzieren Sie das Vakuum auf 100 Millibar und schalten Sie die Vakuumpumpe aus. Nach 30 Minuten heben Sie das Vakuum auf und nehmen den Behälter heraus. Halten Sie den Behälter bedeckt, bis er benötigt wird.

Als Nächstes heizen Sie eine Heizplatte auf 40 Grad Celsius auf und stellen vorsichtig den Behälter mit PDMS und den Glaskügelchen auf die Heizplatte. Decken Sie den Behälter ab und lassen Sie ihn über Nacht aushärten. Nach dem Abkühlen schneiden Sie mit einer Rasierklinge 5 Millimeter große Würfel aus dem PDMS-Guss, sodass jeder Würfel einen Glaskügelchen in seiner Mitte enthält.

Tauchen Sie dann die Spitze einer Nadel in frisch hergestelltes flüssiges PDMS und geben Sie einen Tropfen PDMS auf den gravierten Basisbereich des Wafers. Verteilen Sie den Tropfen so, dass er den 5 Millimeter mal 5 Millimeter großen Basisbereich vollständig bedeckt. Legen Sie abschließend mit einer Pinzette den Würfel, der die Glaskugel enthält, auf den mit flüssigem PDMS bedeckten Basisbereich.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Gerät. Danach übertragen Sie den Wafer auf eine Heizplatte mit 40 Grad Celsius und decken Sie ihn ab, um ihn über Nacht zu trocknen. Verwenden Sie eine scharfe Pinzette, um den Hebelarm vom Wafer abzulösen, und befestigen Sie ihn an der Seitenwand der Basis.

Dann lösen Sie die gesamte Baugruppe vorsichtig von der Wafer-Oberfläche, indem Sie die Basis abziehen. Wiederholen Sie zunächst den Herstellungsprozess, der für die biologischen Aktuatoren bis zum Schritt der Lasergravur verwendet wurde. Verwenden Sie jedoch beim Bau von Biorobotern das Biorobot-Design während des Laserschneidens.

Bereiten Sie anschließend die Mikroballon-PDMS-Mischung und die Nickel-Pulver-PDMS-Mischung wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben vor. Gießen Sie die Lösungen vorsichtig unter Verwendung einer Waage in separate Behälter. Stellen Sie beide Behälter in eine Vakuumkammer und senken Sie den Druck auf 100 Millibar für 30 Minuten ab.

Nach dem Entgasen die Behälter über Nacht auf eine Heizplatte bei 40 Grad Celsius stellen. Mit einer Rasierklinge die Basen der Bioroboter entsprechend der jeweiligen Größe aus jedem der Polymere ausschneiden, wie hier gezeigt. Die Nickel-PDMS-Basis auf eine Metallplatte legen, wobei ein Reinraumtuch dazwischen platziert wird.

Schalten Sie dann die Koronaentladungseinheit ein und führen Sie die Spitze der Einheit 1 Zentimeter über die Basen. Bewegen Sie die Spitze 15 Sekunden lang über die Basis, um die Oberfläche zu behandeln. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Oberfläche der lasergravierten Basen für die gleiche Dauer zu behandeln.

Verwenden Sie dann eine Pinzette, um die behandelte Seite des Nickel-PDMS auf die behandelte Seite des Films zu legen. Lassen Sie das Gerät fünf Minuten lang ruhen, damit sich die Teile miteinander verbinden. Anschließend lösen Sie mit einer scharfen Pinzette den Bioroboter-Kantilever vorsichtig von der Wafer-Oberfläche und platzieren ihn auf der Unterseite der Nickel-PDMS-Basis.

Entfernen Sie anschließend die gesamte Baugruppe von der Waferplatte. Um den Mikroballon aus PDMS an der Baugruppe zu befestigen, bringen Sie zunächst einen kleinen Tropfen ungehärtetes PDMS darauf auf. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um die Seite des Nickel-PDMS mit dem dünnen PDMS-Film auf den Tropfen ungehärteten PDMS zu setzen.

Stellen Sie die gesamte Montage in eine Kunststoff-Petrischale und anschließend auf einen Heizblock bei 40 Grad Celsius, um sie über Nacht aushärten zu lassen. Um die Geräte für die Zellseeding vorzubereiten, geben Sie zunächst 100 Mikroliter einer Fibronectin-Lösung in die Mitte eines separaten T25-Kulturkolbens für jedes Gerät. Danach platzieren Sie den Bioroboter oder den biologischen Aktuator mit der Oberseite nach unten über den Tropfen der Fibronectin-Lösung.

Stellen Sie sicher, dass der Hebelarm entfaltet ist und in dem Tropfen eingetaucht liegt, und inkubieren Sie anschließend den Kolben 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation entfernen Sie die Fibronectin-Lösung und waschen die Geräte zweimal mit PBS. Danach entfernen Sie den PBS und füllen den Kolben mit 10 Milliliter DMEM, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin ergänzt wurde.

Die Vorrichtung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, um das PDMS zu entgasen. Anschließend den Bioroboter mit einem Magneten an der Unterseite des Kolbens fixieren und den Kolben mit den Proben fünf Minuten lang in ein Ultraschallbad stellen, um eventuelle Blasen zu entfernen. Um die geeignete Dicke jeder Verbundschicht zu bestimmen, wurden verschiedene Mischungsverhältnisse mit dem Mischungsverhältnis von Nickel und Mikrohohlkugeln in PDMS getestet.

Die Nickel-PDMS-Schicht ermöglicht die magnetische Steuerung und Stabilität des Roboters. Zusätzlich erlaubt die Mikroballon-PDMS-Schicht dem Bioroboter, stabil zu schwimmen und zu schweben. Die Kombination beider Schichten ergibt das selbststabilisierende Gerüst des Bioroboters.

Mithilfe eines Computerprogramms wurde die Stabilität numerisch analysiert und nachgewiesen, dass ein starkes rückstellendes Moment mit dieser zweischichtigen Methode erzeugt wird. Es ist wichtig, darauf zu achten, dass der Cantilever während des gesamten Verfahrens sauber bleibt, und dass das korrekte Mischverhältnis der PDMS-Mischung sowie die Dicke des Cantilevers eingehalten werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie elastomere Materialien zu einem dünnen Cantilever geformt werden können, um Kardiomyozyten zu tragen, und wie sie modifiziert werden können, um neue Eigenschaften wie Auftrieb oder Magnetismus für erweiterte Funktionen zu erlangen.

Dieses Verifizierungsverfahren kann durch die Einbindung weiterer Techniken, wie beispielsweise die Strukturierung von Ausrichtungswürfeln, modifiziert werden, um die Zellorientierung zu fördern und die vierte Generation zu erhöhen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasergravuren äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter Schutzkleidung und Schutzbrillen sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.