Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen
11. August 2017
Wir bieten ein generalisiertes Protokoll basiert auf einer mikrofluidische Bioprinting Strategie für engineering-ein Microfibrous Kreislauf Bett, wo eine sekundäre Zelle Art weiter in den interstitiellen Raum dieser Microfibrous Struktur, vaskularisierte Gewebe und Organellen zu generieren ausgesät werden konnte.
Das übergeordnete Ziel dieser mikrofluidischen Bioprinting-Methode ist es, ein vaskularisiertes Gewebekonstrukt zu erzeugen. Diese Methode kann Schlüsselfragen in der Biofabrikation von vaskularisierten Geweben lösen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie vielseitig einsetzbar ist, um einen dreidimensionalen, formkontrollierten Gefäßbehälter für die Züchtung von vaskularisierten Geweben durch einen sekundären Zellaussaatprozess zu erzeugen.
Obwohl dieses Protokoll einen Einblick in die Entwicklung von vaskularisiertem Herzgewebe bietet, kann es auch auf viele andere Gewebetypen wie Leber, Haut und sogar Krebs angewendet werden. Allgemeine, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, können Schwierigkeiten haben, da die Einrichtung des Biodruckers möglicherweise nicht einfach ist. Um dieses Verfahren zu starten, konstruieren Sie einen konzentrischen mikrofluidischen Druckkopf mit zwei Schichten, indem Sie eine kleinere stumpfe Nadel, die als Kern dient, in die Mitte der größeren stumpfen Nadel einführen, die als Hülle dient.
Achten Sie darauf, dass die Kernnadel etwa einen Millimeter aus der Außenschale herausragt. Führen Sie danach eine 23-Gauge-Nadel in umgekehrter Richtung in den Lauf der zentralen Nadel ein. Machen Sie ein Loch an der Seite des Zylinders der äußeren Nadel und setzen Sie einen Metallverbinder in der gleichen Größe ein.
Mit Epoxidkleber versiegeln. Montieren Sie den Extruder mit einem Polymethylmethacrylat- oder PMMA-Halter auf den Kopf eines Biodruckers. Als nächstes für die Injektion der Biotinte und der Vernetzungslösung durch zwei PVC-Schläuche einzeln verbinden Sie die Einlässe des Druckkopfes mit einer Zweikanal-Spritzenpumpe.
Stellen Sie die Biotinte mit einer Mischung aus Alginat, gelMA und Photoinitiator her. Gelöst in 25 millimolaren HEPES-Puffern, der 10 % fötales Rinderserum oder FBS enthält. Stellen Sie dann eine Lösung von 0,3 molaren Calciumchlorid in HEPES-Puffer her, der 10 % FBS enthält, um als vernetzende Trägerflüssigkeit zu dienen.
Unmittelbar vor dem Bioprinting trypsinisieren Sie menschliche Nabelvenendothelzellen oder HUVECs für fünf bis 10 Minuten. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 800 U/min in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Resuspendieren Sie die Zellen in der Biotinte in einer Konzentration von fünf bis 10 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter, indem Sie langsam fünf- bis zehnmal pipettieren.
Verwenden Sie anschließend eine Zweikanal-Spritzenpumpe, um die Injektion der HUVECs laiden Bioink durch einen Kanal und der Vernetzungsflüssigkeit durch den anderen Kanal mit einer Durchflussrate von fünf Mikrolitern pro Minute zu starten. Lassen Sie die Flüsse bis zu einer Minute lang ununterbrochen laufen, bis sie sich stabilisieren. Danach starten Sie die Druckkopfbewegung, indem Sie die Abscheidungsgeschwindigkeit des Bioprinters von etwa vier Millimetern pro Sekunde beibehalten.
Dieses Bioprinting soll zu einer schnellen ionischen Gelierung der Alginatkomponente und zur Ablagerung eines Mikrofasergerüsts führen. Nachdem das Gerüst gedruckt wurde, vernetzen Sie die gelMA-Komponente 20 bis 30 Sekunden lang mit fünf bis 10 Milliwatt pro Quadratzentimeter UV-Licht, um eine chemische Gelierung zu erreichen. Entfernen Sie dann das überschüssige Calciumchlorid vom Gerüst, indem Sie es vorsichtig mit 37 Grad Celsius warmem PBS abspülen.
Kultivieren Sie dieses Gerüst in einem Endothelzellwachstumsmedium bei 37 Grad Celsius in fünf Volumenprozent CO2 für bis zu 16 Tage. Wechseln Sie das Medium mindestens alle zwei Tage. Überwachen Sie während der Kulturperiode die HUVECs unter einem Mikroskop, bis sie an die Peripherien der Gerüstmikrofasern wandern und lumenartige Strukturen bilden.
Entfernen Sie dann vorsichtig das gesamte Medium mit Kapillarkraft mit einem Stück sterilem Filterpapier aus dem intrastitiellen Raum des Gerüsts. Geben Sie sofort einen Tropfen Suspension eines sekundären Zelltyps wie Kardiomyozyten auf das Gerüst, so dass die Zellen den gesamten intrastitiellen Raum infiltrieren können. Danach inkubieren Sie dieses Gerüst in einem Inkubator für 30 Minuten bis zwei Stunden, damit die Zellen an den einzelnen Mikrofasern haften können.
Entfernen Sie nicht anhaftende Zellen, indem Sie das Gerüst vorsichtig mit PBS waschen. Kultivieren Sie dieses Gerüst in geeignetem Medium, bis das gewünschte vaskularisierte Gewebe gebildet ist. Das hier beschriebene mikrofluidische Bioprinting ermöglicht das direkte Bioprinting von mikrofibrösen Gerüsten unter Verwendung von niedrigviskosen Biotinten.
Ein Gerüst, das sechs mal sechs mal sechs Quadratmillimeter groß ist < mehr als 30 Mikrofasern enthält, könnte innerhalb von 10 Minuten biogedruckt werden. Drauf- und Seitenansichten von Gerüstmikroskopaufnahmen zeigen die hervorragende strukturelle Integrität während des Bioprinting-Prozesses. Erreicht durch die sofortige ionische Vernetzung der Alginatkomponente mit Calciumchlorid.
Nach mikrofluidischer Extrusion der Biotinte, Ionenvernetzung und Photovernetzung behielten HUVECs eine relativ hohe Lebensfähigkeit bei. Die Zellen vermehrten sich und wanderten von der anfänglich zufälligen Verteilung am Tag Null in die Peripherien der Mikrofasern am Tag 16. Neugeborene Ratten-Kardiomyozyten, die auf dem Gerüst ausgesät worden waren, reiften und bevölkerten das Gerüst.
Sie zeigten eine starke Expression von funktionellen kardialen Biomarkern. Wie sarkomerisches Alpha-Actinin und Connexin 43. Die konfokale Mikroskopie eines biogedruckten mikrofibrösen Gerüsts, das mit Kardiomyozyten besiedelt war, zeigte die Koexistenz von HUVECs und Kardiomyozyten.
HUVECs sind hauptsächlich an den Grenzen der Mikrofasern vorhanden, während die Kardiomyozyten die Außenseite der Mikrofasern umgeben. Die Zellen waren in der Lage, ihren spontanen und synchronisierten Schlag bis zu neun bis 28 Tage lang aufrechtzuerhalten. Abhängig von der Zellquelle und Konfiguration der Gerüste.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man vaskularisierte Gewebe mit der mikrofluidischen Bioprinting-Technik herstellt, sowie für die Herstellung von Druckköpfen und Bioprinter-Operationen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Herstellung des Druckkopfs und die Bedienung des Biodruckers für Personen, die noch nie einen verwendet haben, schwierig sein können. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die beiden Nadeln im Druckkopf konzentrisch zu machen und den Fluss stabilisieren zu lassen, bevor Sie mit dem Bioprinting beginnen.
Mit der Entwicklung dieser Technik verfügen Forscher auf dem Gebiet des Tissue Engineering und der Biofabrikation nun über ein weiteres Werkzeug, um vaskularisierte Gewebekonstrukte entweder für Regenerationszwecke in vivo oder für die Modellierung von Geweben in vitro zu erzeugen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine mikrofluidische Bioprinting-Methode zur Erzeugung von vaskularisierten Gewebekonstrukten vor. Die Technik begegnet Herausforderungen in der Biofabrikation, indem sie die Herstellung eines dreidimensionalen Gefäßbetts ermöglicht, das mit sekundären Zelltypen besiedelt werden kann.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biofabrikation
- Mikrofluidik
- Gewebetechnik
Hintergrund
- Die Herstellung von vaskularisierten Geweben ist entscheidend für die Entwicklung von Organoiden.
- Bisherige Methoden stoßen bei der Erzeugung komplexer Gewebestrukturen an Grenzen.
- Die mikrofluidische Bioprinting-Technik bietet einen vielseitigen Ansatz, um diese Herausforderungen zu bewältigen.
- Diese Methode kann an verschiedene Gewebetypen angepasst werden, einschließlich kardialen, hepatischen und kutanen Geweben.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Herstellung von vaskularisierten Gewebekonstrukten.
- Verbesserung des Verständnisses biofabrizierter Techniken.
- Schaffung einer Grundlage für zukünftige Anwendungen im Gewebeengineering.
Verwendete Methoden
- Konstruktion eines zweischichtigen konzentrischen Mikrofluidik-Druckkopfs.
- Verwendung einer kleineren stumpfen Nadel als Kern innerhalb einer größeren stumpfen Nadel.
- Einbringen sekundärer Zelltypen in die mikrofaserige Struktur.
- Anwendung der Methode auf verschiedene Gewebetypen jenseits von Herzzeweben.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll erzeugt erfolgreich einen vaskularisierten Gewebekonstrukt.
- Nachgewiesene Vielseitigkeit bei der Herstellung unterschiedlicher Gewebetypen.
- Gewonnene Erkenntnisse zur Konstruktion komplexer Gewebestrukturen.
- Identifizierung potenzieller Herausforderungen für Einsteiger in den Bioprinting-Prozess.
Schlussfolgerungen
- Die mikrofluidische Bioprinting-Methode eignet sich effektiv für die vaskularisierte Gewebeengineering.
- Dieser Ansatz kann Fortschritte in der Organoid-Forschung voranbringen.
- Zukünftige Studien können ihre Anwendung auf andere Gewebetypen und Bedingungen ausweiten.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Mikrofluidisches Bioprinting ermöglicht die Herstellung von vaskularisierten Gewebekonstrukten mit hoher struktureller Genauigkeit und löst damit ein zentrales Engpassproblem bei der Entwicklung präklinischer Modelle. Durch die Erzeugung perfundierbarer mikrovaskulärer Netzwerke in Hydrogel-Scaffolds unterstützt dieses Verfahren die Entwicklung physiologisch relevanterer Gewebemodelle für die Wirkstoffscreening- und Mechanismusforschung. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er eine anpassbare Plattform bietet, um Zell-Zell-Interaktionen, Gewebeausreifung und funktionelle Reaktionen unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und Perizyten oder Stromazellen innerhalb einer definierten vaskulären Nische, um therapeutische Zielstrukturen, die an Angiogenese oder vaskulärer Permeabilität beteiligt sind, zu validieren.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares, mikrofluidisch gesteuertes System zur Erzeugung vaskularisierter Gerüste mit konsistenter Mikrofaserarchitektur und Lumenbildung.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf die vaskuläre Integrität und Zellmigration in einem für den Menschen relevanten, dreidimensionalen Mikroumfeld.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte mikrofaserige Gerüste mit eingekapselten endothelialen Zellen, die lumenaehnliche Strukturen bilden und die quantitative Beurteilung der vaskulären Netzwerkbildung über die Zeit hinweg ermöglichen.
- Operativer Wert: Kompatibel mit der Bioprinting-Technik mittels zweikanaliger Spritzenpumpe, wodurch eine präzise Steuerung der Bioink- und Vernetzungsflüssigkeitszufuhr für die hochdurchsatzfähige Herstellung von Gerüsten ermöglicht wird.
- Eignung für Assays: Erzeugt Gerüste mit mehr als 30 Mikrofasern in einem Volumen von 6x6x6 mm innerhalb von 10 Minuten und unterstützt so die skalierbare Vorbereitung für die nachgeschaltete Aussaat sekundärer Zellen und die Wirkstoff-Screening-Analysen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die sekundäre Aussaat von Kardiomyozyten oder anderen parenchymalen Zellen in den interstitiellen Raum und erleichtert so die Untersuchung der Reifung vaskularisierter Gewebe sowie der synchronisierten kontraktilen Funktion.
- Translationale Kontinuität: Unterstützt die Langzeitkultur (>16 Tage) mit Überwachung der Zellmigration, Lumenbildung und Biomarker-Expression (z. B. sarkomerisches alpha-Aktinin, Connexin 43) zur Modellierung von Gewebe-ebenen Reaktionen.
- Risikominderung: Ermöglicht die Beurteilung von Zellviabilität, Proliferation und funktioneller Reifung unter perfusionsähnlichen Bedingungen und verringert so das Ausscheiden aufgrund einer schlechten vaskulären Einheilung in späteren Stadien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Optimierung ein und bietet eine vaskularisierte Plattform, die einfache Monokulturen und komplexe In-vivo-Modelle verbindet.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt Hypothesenprüfungen zu gefäßabhängigen Wegen, indem kontrollierte Ko-Kulturen von endothelialen und parenchymalen Zellen in einer definierten 3D-Geometrie ermöglicht werden.
- Screening: Bietet assaysbereite Gerüste mit reproduzierbarer Mikrostruktur und Endothelialisierung, die zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Gefäßstabilität und Gewebeorganisation geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Auswertungen mittels konfokaler Mikroskopie der Zellverteilung, Lumenbildung und Biomarker-Kokalokalisation zur Beurteilung der Gewebequalität und funktionellen Reifung.
- Translationale Forschung: Modelliert die Entwicklung von vaskularisiertem Gewebe – von der frühen Bildung endothelialer Netzwerke bis zur Integration sekundärer Zellen – und unterstützt so die präklinische Validierung von gefäßzielgerichteten oder regenerativen Wirkstoffkandidaten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Design des mikrofluidischen Druckkopfs und das Bioink-System (GelMA-Alginat mit ionischer/photokreuzvernetzender Vernetzung) stellen eine wiederverwendbare Plattform dar, die an verschiedene Gewebetypen (kardial, Leber, Haut) sowie an unterschiedliche sekundäre Zelltypen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert die Vorhersagesicherheit, indem vaskularisierte Gewebe mit perfundierbaren, lumengleichen Strukturen und nachhaltiger zellulärer Funktion erzeugt werden (z. B. synchronisiertes Schlagverhalten bis zu 28 Tage).
- Operationaler Wert: Ermöglicht die Standardisierung der Gerüstherstellung durch mikrofluidische Strömungsregelung und verringert so die Variabilität hinsichtlich Mikrofaserdurchmesser, Vernetzungseffizienz und Zellverteilung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung zwischen Fortführung und Abbruch von Projekten, indem frühzeitige Erkenntnisse über vaskuläre Verträglichkeit und gewebeebenen Reaktionen bereitgestellt werden und späte Ausfälle aufgrund unzureichender Vaskularisierung reduziert werden.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf deren Wirkung in einem menschlich relevanten, vaskularisierten Gewebemodell, das wesentliche strukturelle und funktionelle Merkmale nachbildet.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Herstellung mikrofluidischer Vorrichtungen, einschließlich der Montage konzentrischer Nadeln und der Abdichtung mit Epoxidharz, um Leckagen zu vermeiden.
- Abhängig von einem zweikanaligen Spritzenpumpensystem und UV-Licht-Vernetzungsausrüstung für die präzise Zufuhr von Bioink und die Stabilisierung von GelMA.
- Erfordert die Optimierung der Zellkonzentration (5–10×10⁶ HUVECs/mL) und der Flussraten (5 µL/min), um die Zellviabilität und eine gleichmäßige Einschließung während des Drucks sicherzustellen.
- Benötigt aseptische Handhabung und sterile Filterpapiere zur Mediumentfernung während der sekundären Zellseeding, um Kontaminationen zu vermeiden und eine ordnungsgemäße Infiltration zu gewährleisten.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit eines Nachwaschschritts nach dem Druck, um überschüssiges Calciumchlorid zu entfernen, was einen manuellen Arbeitsschritt hinzufügt, der zwischen den Chargen standardisiert werden muss.
