Transkranielle elektrische Hirnstimulation in Alert Nagetiere

Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Eingriffs besteht darin, zuverlässige und wiederholte transkranielle elektrische Hirnstimulationen bei wachen Nagetieren zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Neuromodulation und Neuroplastizität zu beantworten, indem gezielte elektrische Stimulation von Hirnnetzwerken die motorische Funktion verbessert oder Defizite behebt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie wiederholte, nicht-invasive elektrische Hirnstimulationssitzungen bei wachen Nagetieren erlaubt, ohne Unbehagen hervorzurufen und mit minimaler Beeinträchtigung der Verhaltensmessungen.

Personen, die neu in dieser Methode sind, könnten Schwierigkeiten haben, da das Auffinden des richtigen Tunnels vom Brustkorb zum Kopf sowie die Knochenpräparation vor der Platzierung der Elektrodendose für unerfahrene Untersucher oft schwierig durchzuführen ist. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die chirurgischen Schritte zur Platzierung der Elektrodendose sowie die Vorbereitung und Positionierung der Elektroden für die Stimulation für den Erfolg der Experimente von großer Bedeutung sein werden. Unsere Doktorandin, Stephanie Haschka, wird bei der Durchführung der NEBS-Verfahren bei wachen Ratten assistieren.

Beginnen Sie damit, das Nagetier in Bauchlage auf den Operationstisch zu legen. Desinfizieren Sie die rasierte Kopfhaut mit einem in antiseptisches Mittel getränkten Tupfer. Lassen Sie es an der Luft trocknen.

Danach, nach Überprüfung der Narkosetiefe, die Haut mit einem Skalpell in einer Linie vom Augenhöcker bis zur Augenmitte aufschneiden. Anschließend die Ratte in Rückenlage drehen, sodass der Brustkorb freiliegt, und den Brustkorb desinfizieren. Die seitliche Haut des rechten Brustbereichs mit zwei Fingern straff ziehen und einen geraden sagittalen Schnitt in kranialer Ausrichtung anlegen.

Bilden Sie eine subkutane Tasche, indem Sie die Haut atraumatisch vom linken großen Brustmuskel lösen, indem Sie die kleine Schere wiederholt öffnen. Drehen Sie dann das Tier auf die rechte Seite und führen Sie den Kabelweg von der linken okzipitalen Ecke der offenen Kopfhaut entlang des Halses bis in die Brustmuskeltasche. Durchdringen Sie dazu die oberflächliche Faszie mit hämostatischen Pinzetten.

Öffnen Sie die homöostatischen Pinzette vorsichtig, um das Ende des Elektrodenkabels, das an der Platinelektrode befestigt ist, zu erfassen, wobei scharfe Drähte nicht herausragen dürfen. Ziehen Sie das Kabel durch den Tunnel, bis die Elektrode mit der Koagulationsspitze in Richtung des linken Hinterbeins des Nagetiers in die Tasche eindringt. Drehen Sie das Nagetier anschließend wieder in die Bauchlage.

Befestigen Sie anschließend die Platinplatte mit einer sterilen synthetischen geflochtenen nicht resorbierbaren Naht an der Brustfascia an den beiden gegenüberliegenden Ecklöchern. Befestigen Sie auf ähnliche Weise das Kabel mit einem lockeren Knoten, der vor dem Eintritt in den Gewebetunnel eine leichte Schlaufe bildet, an der Fascia. Schließen Sie schließlich die Haut mit drei bis vier kutanen Nähten, abhängig von der Größe des Schnitts.

Entfernen Sie zunächst das Periost, das Bindegewebe an den Seiten des Schädels, mit dem Skalpell und wischen Sie die Fläche gründlich mit Wattestäbchen ab. Befestigen Sie das Bindegewebe an den vier Ecken des Schnitts mit Klemmen (Bulldog-Clamps) und lassen Sie es seitlich herunterhängen, um das Operationsfeld offen zu halten. Anschließend reinigen Sie die Knochenoberfläche und das Gewebe mit 0,9 %iger Kochsalzlösung unter Verwendung von Wattestäbchen.

Reinigen Sie dann die Knochenoberfläche mit 3 % Wasserstoffperoxid. Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um alle sichtbaren Reste des Periosts zu entfernen. Da Fixierschrauben die Haftung des Betäubungsmittels verbessern, wählen Sie einen Bohrer, der zur Schraubengröße passt.

Legen Sie zwei Bohrlöcher in zwei verschiedene Knochenplatten an, indem Sie zunächst mit einem Handbohrer vorbohren und anschließend leicht mit einem Knochenbohrer unter Partikeldruck arbeiten. Falls, wie in diesem Video gezeigt, eine Elektrode implantiert wird, bohren Sie ein drittes Loch im rechten hinteren Parietalknochen für die spätere Fixierung des unter der Haut verlegten Kabels. Setzen Sie die Kunststoffschrauben in die Bohrlöcher ein und schrauben Sie, bis der erste Widerstand spürbar ist.

Danach drei weitere 180-Grad-Schraubumdrehungen durchführen. Mit einer Pinzette die Stabilität der Schraube überprüfen und gegebenenfalls eine weitere Umdrehung hinzufügen, falls sie nicht fest genug sitzt. Das Koagulationsbesteck einschalten und etwa fünf Minuten vorheizen.

Wickeln Sie das aus dem Gewebetunnel austretende Kabel okzipital um die rechte parietale Schraube und schneiden Sie es dann ab, wobei etwa ein Zentimeter Kabel hinter der Wicklung verbleibt. Entfernen Sie vorsichtig die Isolierung am Ende des Kabels mit einem Skalpell. Befestigen Sie anschließend das gewickelte Kabel mit Cyanoacrylat-Kleber an der Schraube und am Knochen.

Als Nächstes eine kleine Menge des bleifreien Zinnlotes auf den Anschluss und die blanken Adern des Gegenelektrodenkabels auftragen und beide Teile verbinden, indem die vorverlöteten Abschnitte kurz zusammengedrückt werden, während die Lötspitze berührt wird, bis das Zinnlot schmilzt. Die Lötspitze sofort entfernen, um eine übermäßige Erhitzung des Kabels und damit verbundene Gewebeschäden zu vermeiden. Zur Stimulation der motorischen Großhirnrinde eine Buchse mit vier Millimeter Durchmesser verwenden.

Nehmen Sie die speziell angefertigte tES-Elektrodenbuchse mit einer feinen gezackten Pinzette auf und tragen Sie eine dünne Schicht Cyanoacrylat-Kleber auf den unteren Rand der Buchse auf. Der intermediale Rand der Buchse sollte direkt an der sagittalen Naht enden, und der innere Rand der Buchse sollte am Bregma enden. Drücken Sie die Buchse anschließend kurz auf den Knochen, bis der Kleber aushärtet.

Und verwenden Sie eine Beleuchtung, um sicherzustellen, dass der Knochen im Bereich der Hülse kein reflektierendes Klebstoffmittel aufweist. Nachdem die Hülse an ihrem Platz sitzt und der zukünftige Stimulationsbereich frei von Klebstoff ist, verschließen Sie die seitliche Begrenzung der Hülse mit einem kleinen Tropfen Cyanacrylat-Klebstoff gegenüber dem benachbarten Gewebe, um eine Flüssigkeitsbrücke zu vermeiden, die an dieser Stelle zu einer Stromableitung führen könnte. Anschließend decken Sie alle Schrauben mit Cyanacrylat-Klebstoff ab.

Mischen Sie anschließend die beiden Komponenten zu einem Acrylzement in einem kleinen Silikonröhrchen oder Glas. Sobald die Masse viskos wird, tragen Sie sie mit einem zahnärztlichen Spatel auf, um die verbleibenden Ränder der Buchse mit dem Knochen abzudichten. Decken Sie abschließend den gesamten Schädel, die Schrauben, das Gegenelektrodenkabel und bis zu einem Drittel der Buchse mit zahnmedizinischem Acrylzement ab.

Nachdem der gesamte Knochen bedeckt ist und der Zement ausgehärtet hat, entfernen Sie die Bulldog-Clamps und positionieren Sie die Haut erneut. Füllen Sie zunächst die tES-Elektrodenbuchse zur Hälfte mit 0,9 %iger Kochsalzlösung und entfernen Sie Luftblasen. Vor kathodalen tES-Sitzungen überprüfen Sie die Chlorierung und chlorieren Sie die Silber-Silberchlorid-Elektrode gegebenenfalls erneut.

Vor anodalen tES-Sitzungen mögliche überschüssige Silberchloridablagerungen aus vorherigen Stimulationsvorgängen mit Schleifpapier entfernen, um während der Stimulation eine gute Leitfähigkeit zu gewährleisten. Anschließend die tES-Elektrodenkappe einschrauben. Die Kabel mit den beiden Anschlüssen am Kopf verbinden.

Bringen Sie dann das Nagetier in den Versuchskäfig, wobei die Kabel mit einem Drehverbinder über dem Käfig verbunden bleiben, der freie Bewegung ermöglicht. Schalten Sie den Stimulator ein und stellen Sie die Stimulationsparameter ein. Trennen Sie abschließend nach Beendigung der Stimulation die Kabel, schrauben Sie die Elektrodenkappe vom Kopf ab und reinigen und trocknen Sie die Buchse mit einem Wattestäbchen.

Die Ergebnisse zeigten, dass die durch morphologische Veränderungen bewertete Mikroglia-Aktivierung erstmals bei 31,8 Ampere pro Quadratmeter auftrat, während die ersten Anzeichen einer Neurodegeneration bei 47,8 Ampere pro Quadratmeter nachgewiesen wurden. Die Proben eins bis vier wurden als positiv eingestuft. Die Anästhesie beeinflusste die Stärke der Reaktion auf DCS, da der Prozentsatz von Hirnschnitten mit fluoro-JC-positiven degenerierenden Neuronen bei wachen Ratten bei 47,8 Ampere pro Quadratmeter höher war.

Außerdem wird erwartet, dass Verhaltens- oder molekulare Effekte bei hohen Intensitäten mechanistisch anders sind als Effekte bei niedriger Intensität. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie einschließlich der Platzierung der Brustelektroden bei korrekter Durchführung in 40 bis 45 Minuten durchgeführt werden. Wenn keine Gegenelektrode chirurgisch platziert wird, ist üblicherweise eine kürzere Dauer von 10 bis 15 Minuten erforderlich.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine dauerhafte Elektrodenanordnung für die verschiedenen NEBS-Simulationstechniken platziert und wie man einen eTS bei wachen Nagetieren anwendet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit elektrischen Strömen für das Nagetier schädlich sein kann, wenn die Elektroden vor der Stimulation nicht ausreichend vorbereitet wurden. Vorsichtsmaßnahmen wie die Re-Chlorierung der Elektrode vor der kathodalen Stimulation oder die Entfernung von Ablagerungen vor der anodalen Stimulation sollten stets vor Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.