Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden

Das übergeordnete Ziel der chemischen Funktionalisierung der Oberfläche von HEV-Nanopartikeln besteht darin, einen reproduzierbaren und konsistenten Ansatz zur Konjugation von gezielten immunogenen, therapeutischen und diagnostischen Molekülen an die Oberfläche von HEV-Nanopartikeln für diagnostische und therapeutische Zwecke bereitzustellen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Nanomedizin zu beantworten, beispielsweise wie eine verbesserte gezielte Wirkstoffabgabe bei Krebs und die Verteilung von nanostrukturierten Therapeutika überwacht werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie hochgradig reproduzierbar, effizient und im Vergleich zur Erzeugung genetischer Veränderungen deutlich einfacher zu realisieren ist.

Die Verfahren werden Michelle Nguyen und Ivan Ruiz, wissenschaftliche Mitarbeiter aus unserem Labor, demonstrieren.

Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Herstellung und Reinigung von Nanopartikeln des Hepatitis-E-Virus, wie im Textprotokoll beschrieben.

Verdünnen Sie die HEV-Nanopartikelproben auf eine Konzentration zwischen 0,5 und zwei Milligramm pro Milliliter mit 10 Millimolar MES, pH 6,2, für eine TEM-Aufnahme. Ionisieren Sie die mit Kohlenstoff beschichteten Gitter durch eine 30 Sekunden dauernde Glühentladung mit 40 Milliampere, um eine hydrophile Kohlenstoffoberfläche zu erzeugen. Die hydrophile Kohlenstoffoberfläche der Gitter hält nur 30 Minuten nach der Glühentladungsbehandlung an. Führen Sie nach der Ionisierung das Gitter mit der Pinzette und geben Sie zwei Mikroliter der HEV-Nanopartikelprobe auf das Gitter.

Nach 15 bis 30 Sekunden die Probe mit Filterpapier abtupfen. Anschließend die Probe sofort mit doppelt destilliertem Wasser waschen und erneut mit Filterpapier abtupfen. Unmittelbar zwei Mikroliter zweiprozentige Uranylacetat-Lösung auf die Probe geben. Nach 15 Sekunden die Probe erneut mit Filterpapier abtupfen. Die Probenraster über Nacht in einem elektronischen Trockenentfeuchter-Schrank trocknen lassen.

Je nach Probe kann eine kryogene Elektronenmikroskopie oder Kryo-EM zur Strukturvisualisierung und -charakterisierung erforderlich sein. Überführen Sie das Gitter in ein TEM und nehmen Sie Bilder mit einer 10- bis 80.000-fachen Vergrößerung auf. HEV-Nanopartikel erscheinen im TEM als leere ikosaedrische Proteine mit einem Durchmesser von etwa 27 Nanometern, bedingt durch das Fehlen viraler RNA.

Um die Einstufen-Konjugation von HEV-Nanopartikeln und maleimidverknüpftem Biotin durchzuführen, tragen Sie zunächst die HEV-Nanopartikel auf Mini-Dialyseeinheiten auf. Dialysieren Sie die Nanopartikel gemäß Herstellervorschrift eine Stunde lang bei Raumtemperatur gegen 0,01 molares PBS, pH 7,4. Nach der Dialyse überführen Sie die HEV-Nanopartikel in 1,5-Milliliter-Röhrchen und bestimmen die Protein-Konzentration bei 280 Nanometern mithilfe eines Spektrophotometers. Mischen Sie die Nanopartikel bei einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter mit einer gleichen Menge 100 Mikromolar Maleimid-Biotin und 0,01 molarem PBS, pH 7,4, um ein molares Verhältnis von eins zu fünf zu erhalten. Nach der Umsetzung über Nacht bei vier Grad Celsius entfernen Sie nicht gebundenes Maleimid-Biotin mittels einer Spin-Desalzierungssäulenprozedur gemäß Herstellervorschrift. Analysieren Sie die Proben durch eine standardmäßige reduzierende SDS-Gelelektrophorese.

Erstellen Sie nach den Standardverfahren mittels HRP-gekoppeltem Streptavidin einen chemilumineszenten Western-Blot und nehmen Sie das chemilumineszente Signal mit Röntgenfilm auf.

Um eine zweistufige Konjugation des brustkrebsspezifischen Liganden LXY30 an oberflächenexponierte Cysteinreste auf HEV-Nanopartikeln durchzuführen, pipettieren Sie zunächst die Nanopartikel in Mini-Dialyseeinheiten und dialysieren sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur gegen 0,01 molares PBS, pH 7,4. Danach überführen Sie die HEV-Nanopartikel in 1,5-Milliliter-Röhrchen und bestimmen die Protein-Konzentration bei 280 Nanometern mithilfe eines Spektrophotometers. Anschließend mischen Sie 650 Mikromolar Maleimid-Azid und 650 Mikromolar Alkin-LXY30 mit 200 Mikromolar Kupfersulfat und 1 Millimolar Ascorbinsäure. Dadurch entsteht ein 650 Mikromolar lösliches, maleimidverknüpftes LXY30. Inkubieren Sie das Gemisch über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag mischen Sie die HEV-Nanopartikel, auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter eingestellt, mit etwa 10 % Volumen des maleimidverknüpften LXY30, um ein molares Verhältnis von eins zu drei zu erreichen. Reagieren Sie die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius. Aufgrund der relativ hohen Konzentration an maleimidverknüpftem LXY30 werden die Endkonzentrationen der Reaktanten wie Kupfersulfat nach dem Mischen etwa zehnmal verringert. Um Schäden an den Hepatitis-E-Virus-Nanopartikeln zu vermeiden, ist eine alternative Methode die kupferfreie Click-Reaktion.

Entfernen Sie den nicht gebundenen Maleimid-Click-LXY30 mithilfe einer Spin-Desalting-Säule gemäß dem Herstellungsprotokoll. Bewahren Sie die LXY30-gebundenen HEV-Nanopartikel bei vier Grad Celsius auf. Um die Einstufen-Konjugation der LXY30-HEV-Nanopartikel und des Cy5,5-Fluoreszenzmarkierung durchzuführen, mischen Sie zunächst die LXY30-gebundenen Nanopartikel auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter mit einem gleichen Volumen der Cy5,5-Fluoreszenzmarkierung, um ein molares Verhältnis von eins zu fünf zu erhalten. Nach der Umsetzung der Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius entfernen Sie das nicht gebundene Cy5,5-NHS mithilfe eines Spin-Desalting-Säulenverfahrens gemäß dem Herstellungsprotokoll. Bewahren Sie die LXY30-Cy5,5-gebundenen HEV-Nanopartikel bei vier Grad Celsius auf.

Für die LXY30-Funktionalisierung von HEV-Nanopartikeln zur gezielten Ansprache von Tumorzellen wurden zwei Methoden versucht. Wenn HEV-573C-Nanopartikel zunächst an Maleimidazid gebunden und anschließend über eine Click-Chemie-Reaktion mit LXY30-Alkin versehen wurden, schienen sich die HEV-573C-Nanopartikel unter TEM-Beobachtung aufzulösen. Im Gegensatz dazu blieb die Struktur erhalten, wenn zunächst eine Click-Chemie-Reaktion zwischen LXY30-Alkin und Maleimidazid durchgeführt wurde, um maleimidverknüpftes LXY30 herzustellen, das anschließend an modifizierte HEV-Nanopartikel konjugiert wurde; die HEV-573C-Nanopartikel blieben intakt. LXY30- und Cy5,5-markierte HEV-Nanopartikel wurden auf kultivierten Brustkrebszellen aufgebracht und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Nahinfrarot-Fluoreszenzbilder der konfokalen Mikroskopie zeigen, dass LXY30-Cy5,5-markierte HEV-Nanopartikel eine höhere Bindungsaffinität und stärkere Internalisierung in MDA-MB-231-Brustkrebszellen aufwiesen im Vergleich zu Cy5,5-markierten HEV-Nanopartikeln.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Untersuchung multimodaler Targeting- und therapeutischer Moleküle, die eine präzise Anvisierung und Diagnose von Tumoren ermöglichen, ohne normale Zellen zu schädigen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Krebs- und Tumortargeting durch chemische Oberflächenmodularisierung liefern kann, ist sie auch auf die frühe Krebsdiagnose, Screening-Verfahren und bildgestützte Therapie anwendbar.