Übung Messhöhen in Drosophila Melanogaster mit der rotierenden Bewegung Quantifizierung System (Anforderung)
27. Mai 2018
Die rotierende Bewegung Quantifizierung System (REQS) induzieren können Übung in Drosophila Melanogaster durch Rotation während der Messung gleichzeitig der Höhe der Aktivität von den Tieren durchgeführt. Hier präsentieren wir Ihnen ein Punkt-für-Punkt-Protokoll Details wie Aktivität der Tiere erleben rotatorische Bewegung Behandlungen mit der REQS. zu messen
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Bewegungsbiologie zu beantworten, z. B. wie sich die Trainingsreaktion bei Tieren unterschiedlichen Alters unterscheidet und welche genetischen Signalwege die Trainingsreaktion steuern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Forschern zum ersten Mal ermöglicht, die Aktivität von Fliegen zu messen, die rotationsinduzierte Übungen in Echtzeit ausführen. Das Verfahren wird von Louis Patrick Watanabe, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert.
Vor dem geplanten Experiment werden Kreuzungen aus männlichen und weiblichen Fliegen aufgestellt, damit jeder kontrollierte Nachkommen für das Experiment gesammelt werden kann. Laden Sie zunächst acht Glasprobenröhrchen mit 10 betäubten Reagenzfliegen pro Fläschchen. Eine Standard-Versuchsgruppe besteht aus 10 Fläschchen mit 10 Fliegen jedes Geschlechts.
Um die Fläschchen in das REQS zu laden, setzen Sie das Fläschchen von vorne in einen Schlitz des Aktivitätsmonitors ein. Setzen Sie dann die zweite Kappe auf das Fläschchen und zentrieren Sie das Fläschchen, indem Sie den O-Ring nach Bedarf bewegen. Bringen Sie das REQS in einem Inkubator für kontrollierte Umgebungsbedingungen unter.
Lassen Sie die Tiere sich eine Stunde lang in diesem Inkubator von der Narkose erholen, bevor Sie fortfahren. Für Assays, die länger als acht Stunden dauern, können Fläschchen mit Lebensmitteln verwendet werden, die sehr sicher an einem Ende des Röhrchens befestigt sind. Schalten Sie das Gerät nach der Eingewöhnungsphase ein, um die Umdrehungen zu starten.
Stellen Sie die Geschwindigkeit auf die gewünschte Geschwindigkeit ein, z. B. vier U/min. Kein Rohr sollte die Unterseite berühren, wenn es richtig positioniert ist. Für einen typischen Assay starten Sie einfach die Software und zeichnen die Aktivität für die gewünschte Zeit auf, z. B. für zwei Stunden bei der Verwendung von Fläschchen ohne Futter.
Beim Start speichert die Software die Daten automatisch in einer Textdatei. In der Software zeigt eine grüne Verbindungsleuchte an, dass die Software Daten sammelt. Die Aufnahmefrequenz kann auf der Registerkarte "Einstellungen" angepasst werden.
In der Regel werden Fünf-Minuten-Intervalle verwendet. Öffnen Sie während des Assays den Inkubator nicht, da die Tiere sehr empfindlich auf Störungen reagieren und wahrscheinlich mit erhöhter Aktivität reagieren. Beenden Sie am Ende des Assays die Datenerfassung, indem Sie die Software schließen, schalten Sie dann die REQS aus und überprüfen Sie die Röhrchen.
Notieren Sie sich alle Todesfälle, die während des Trainingsprogramms aufgetreten sind. Im Allgemeinen sind vier Umdrehungen pro Minute für zwei Stunden für gesunde Stämme nicht tödlich. Entladen Sie schließlich die Fläschchen, indem Sie die Fliegen mit Kohlendioxid betäuben.
Die Datendatei kann mit jedem Statistikpaket analysiert werden. Wenn es Zeitpunkte gibt, zu denen für alle Positionen ein Aktivitätsscore von Null aufgezeichnet wird, dann gab es während dieser Zeitpunkte einen Ausschnitt in der Verbindung. Wenn Ausschnitte auftreten, stabilisieren Sie die Verbindungen, die zur drehbaren Telefonbuchse führen, mit Klebeband.
Vier genetisch unterschiedliche Drosophila-Linien wurden mit dem REQS unter Verwendung des beschriebenen Protokolls untersucht. Jede Gruppe bestand aus 100 Fliegen, die in 10 Fläschchen aufgeteilt wurden. Die durchschnittliche Aktivität wurde in Fünf-Minuten-Bins über den zweistündigen Assay berechnet, der bei vier Umdrehungen pro Minute durchgeführt wurde.
Die mittlere Bewegungsaktivität zwischen allen vier Genotypen war signifikant unterschiedlich, es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen jungfräulichen männlichen und jungfräulichen weiblichen Fliegen gefunden, so dass ihre Daten in dieser Analyse zusammen präsentiert werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Bewegungsgenetik, um verschiedene Trainingsreaktionen bei Drosophila melanogaster zu erforschen und die Auswirkungen von Bewegung auf das Verhalten und die Physiologie von Tieren zu untersuchen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. Analysen der Körperzusammensetzung, Stresstests und Fitnesstests, verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu den Auswirkungen von Bewegungsbehandlungen auf die Tiere zu beantworten.
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Übersicht
Das Rotating Exercise Quantification System (REQS) ermöglicht die Induktion von Bewegung bei Drosophila melanogaster durch Rotation, während die Aktivitätsniveaus gemessen werden. Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie die Aktivität von Fliegen bewertet werden kann, die rotatorischen Bewegungsbehandlungen unterzogen werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Trainingsbiologie
- Verhaltensanalyse
- Genetische Signalwege
Hintergrund
- Verständnis der Trainingsreaktion in verschiedenen Altersgruppen.
- Untersuchung genetischer Signalwege, die die Trainingsreaktion beeinflussen.
- Echtzeitmessung der Aktivität von Fliegen während des Trainings.
- Nutzung des REQS für experimentelle Aufbauten.
Zweck der Studie
- Die Aktivitätsniveaus bei Drosophila während einer Rotationsbelastung messen.
- Untersuchen, wie die Reaktion auf körperliche Betätigung mit dem Alter und der Genetik variiert.
- Einen Protokollablauf bereitstellen, den Forscher zur Reproduktion der Studie nutzen können.
Verwendete Methoden
- Einrichtung von Kreuzungen zwischen männlichen und weiblichen Drosophila.
- Befüllen von Glaspräparatgefäßen mit anesthetisierten Testfliegen.
- Standardmäßige experimentelle Gruppe, bestehend aus mehreren Fläschchen mit Fliegen.
- Echtzeitüberwachung der Aktivität während der Rotationsbelastung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Induktion von Bewegung bei Drosophila mittels REQS.
- Echtzeit-Datenerfassung über die Aktivitätslevel der Fliegen.
- Erkenntnisse zu altersbedingten Unterschieden in der Bewegungsreaktion.
- Identifizierung genetischer Signalwege, die das Bewegungsverhalten beeinflussen.
Schlussfolgerungen
- Die REQS ist ein wertvolles Werkzeug, um die Trainingsbiologie bei Drosophila zu untersuchen.
- Die Echtzeitmessung verbessert das Verständnis der Reaktionen auf körperliche Belastung.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf dieser Methodik aufbauen, um genetische Einflüsse zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Quantifizierung der durch Bewegung induzierten Aktivität bei Drosophila melanogaster mithilfe des Rotating Exercise Quantification System (REQS) ermöglicht eine präzise Messung verhaltensrelevanter Phänotypen für genetische und physiologische Untersuchungen. Diese Fähigkeit unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien sowie die mechanistische Risikominimierung in Entdeckungsprozessen, die auf Bewegungsbiologie, metabolische Regulation und Verhaltensgenetik ausgerichtet sind. Standardisierte, quantitative Ergebnisse aus dem REQS erleichtern den Vergleich zwischen verschiedenen Stämmen und unter verschiedenen Bedingungen und erhöhen somit die Vorhersagegenauigkeit für translationsorientierte Forschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der genetischen und physiologischen Signalwege, die der Reaktion auf körperliche Betätigung in einem überschaubaren Modell zugrunde liegen.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch Quantifizierung von Aktivitätsänderungen über verschiedene Genotypen, Geschlechter und experimentelle Variablen hinweg.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung, indem zeitgleiche, quantitative Verhaltensdaten bereitgestellt werden.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit für nachgeschaltete Studien durch die Standardisierung der körperlichen Belastung über alle Gruppen hinweg.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erstellt validierte, reproduzierbare Verhaltensassays für die Untersuchung von Substanzen oder genetischen Faktoren bei Drosophila.
- Liefert quantitative, zeitlich aufgelöste Aktivitätsdaten, die für die Hochdurchsatzanalyse geeignet sind.
- Ermöglicht die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays über mehrere Experimentdurchläufe und Forschungsteams hinweg.
- Unterstützt die skalierbare Untersuchung von Modulatoren der durch körperliche Betätigung induzierten Aktivität.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimmt mit krankheitsrelevanten Phänotypen wie Stoffwechselregulation und Stressantwort überein, sofern durch nachgeschaltete Assays unterstützt.
- Gewährleistet Kontinuität von der genetischen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung in Modellorganismen.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung durch Klärung der Genotyp-Phänotyp-Beziehungen.
- Unterstützt die prädiktive Risikominimierung für die translationale Biomarkerentwicklung, wenn mit zusätzlichen Endpunkten kombiniert.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die REQS-Methode ist in den frühen Entdeckungsprozess integriert und verbindet genetische Manipulation, Verhaltens-Phänotypisierung und die Entwicklung präklinischer Modelle in der Bewegungsbiologie und verwandten Fachgebieten.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch Quantifizierung der durch Bewegung hervorgerufenen Aktivität über verschiedene genetische Hintergründe hinweg.
- Screening: Stellt assaysbereite, reproduzierbare Verhaltensausgänge für die Bewertung von Substanzen oder genetischen Modulatoren bereit.
- Analytik: Erzeugt quantitative, zeitlich aufgeteilte Aktivitätsdaten für einen belastbaren statistischen Vergleich experimenteller Gruppen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Abstimmung mit krankheitsrelevanten Endpunkten, wenn sie mit physiologischen oder Biomarker-Analysen kombiniert wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte, wiederverwendbare Plattform für die verhaltensmäßige Phänotypisierung in Drosophila-Forschungsportfolios.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der frühen Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Bietet standardisierte, reproduzierbare und skalierbare Verhaltensassays für die Nutzung durch verschiedene Teams.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung über Fortführung oder Einstellung von Projekten sowie die Kapitalnutzungseffizienz, indem Genotyp-Phänotyp-Beziehungen geklärt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung genetischer oder pharmakologischer Zielstrukturen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Drosophila, in der Gestaltung von Verhaltensanalysen und in der statistischen Analyse.
- Benötigt Zugang zum REQS-Gerät, kompatibler Aktivitätsüberwachungssoftware und kontrollierten Umgebungsbedingungen.
- Erfordert eine standardisierte Abstimmung von Testparametern und Datenanalysen über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Kann Anpassungen für verschiedene Fliegenstämme, Altersgruppen oder experimentelle Variablen notwendig machen.
- Zu den möglichen Einschränkungen gehören die Empfindlichkeit gegenüber Umweltstörungen und die Notwendigkeit einer stabilen Datenverbindung.
