Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zum enterischen Nervensystem zu beantworten, wie z.B. das Expressionsprofil von enterischen Ganglien im Darm erwachsener Menschen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um hohe RNA-Ausbeuten aus menschlichen enterischen Ganglien zu erzielen und gleichzeitig die RNA-Qualität maximal zu erhalten. Beginnen Sie mit Darmgewebe, das in 20 Zentimeter Längen geschnitten wird.

Schneiden Sie zunächst das Fett- und Bindegewebe ab. Vermeiden Sie es, die Serosa einzukerben, da dies zu strukturellen Schäden am Plexus myentericus führen kann. Als nächstes wird ein Längsschnitt über die gesamte Länge der getrimmten Probe vorgenommen, vorzugsweise an der Stelle des mesenterialen Ansatzes.

Präparieren Sie dann die Taeniae coli aus dem Dickdarm, damit sich das Gewebe abflachen kann. Spreizen Sie nun den Darm mit der Schleimhautseite nach unten auf ein gekühltes Schneidebrett. Schneiden Sie dann 1,25 Zentimeter breite Streifen entlang der gesamten Länge des Gewebes.

Übertragen Sie jedes Stück während des Schneidens zur vorübergehenden Lagerung in eine gekühlte Gewebeaufbewahrungslösung. Schneiden Sie anschließend jeden Streifen in Segmente, die zwei bis 1,5 Zentimeter lang sind. Nachdem Sie einen Streifen in Segmente geschnitten haben, tupfen Sie die Segmente trocken.

Es ist wichtig, dass das Gewebe sehr trocken ist, damit sich beim Einfrieren keine Eiskristalle auf dem Gewebe bilden. Ordnen Sie nun die getrockneten Gewebestücke mit der Schleimhautseite nach oben auf einer kalten Einweg-Plastikform an. Glätten Sie dann jedes Stück mit einer gebogenen Pinzette, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.

Das Gewebe dehnt sich aus, wenn es abgeflacht wird. Nachdem Sie die Gewebesegmente abgeflacht haben, beurteilen Sie ihre Dicke vor dem Einfrieren. Schieben Sie bei Bedarf die Ränder der Probe nach innen, bis sich die Darmprobe ihrer ursprünglichen Dicke annähert.

Übertragen Sie nun die beladene Grundform auf eine Aufschlämmung aus Trockeneis und 2-Methylbutan. Das Gewebe sollte innerhalb von 30 bis 60 Sekunden vollständig einfrieren. Trocknen Sie dann sofort den Boden der Form mit kalten Tüchern ab, die auf Trockeneis aufbewahrt wurden.

Überprüfen Sie nun die Probe. Achten Sie auf alle Proben, die nicht flach erscheinen. Wickeln Sie die Form anschließend in Aluminiumfolie ein, die vor der Verwendung voretikettiert und gekühlt wurde.

Decken Sie dann die Folie mit einer Schicht Plastikfolie ab, um die Austrocknung zu minimieren. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, bis sie bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden können. Nach der Vorbereitung der erforderlichen Materialien gießen Sie einen drei bis fünf Millimeter großen Haufen TFM auf einen großen Kryostaten-Probenhalter und überführen Sie die Darmprobe sofort mit der Seros-Seite nach oben auf das TFM.

Nach einigen Sekunden bei Raumtemperatur den Probenhalter auf Trockeneis umstellen und mit pulverisiertem Trockeneis bedecken. Stellen Sie vor dem Schneiden sicher, dass sich das TFM unterhalb der Ebene des Plexus myentericus befindet. Montieren Sie anschließend den Probenhalter in den Kryostaten-Probenkopf und richten Sie die Probe mit der Kryostat-Klinge aus.

Machen Sie die Ebene des Plexus myentericus parallel zur Schneidklinge. Machen Sie nun Acht-Mikrometer-Schnitte durch den Seros- und Längsmuskel, bis Sie den Plexus myentericus erreichen. Um den Plexus myentericus zu lokalisieren, montieren Sie eine Probe und färben Sie sie mit einem wässrigen Farbstoff, z. B. 1%Kristallviolett.

Um fortzufahren, identifizieren Sie die Verbindung zwischen der longitudinalen und der kreisförmigen Muskelschicht. Zu Beginn der Schnittung wird die Serosa durch das Vorhandensein von Bindegewebe gekennzeichnet. Entlang der Serosa kann auch etwas verbleibendes Mesenterialfett vorhanden sein.

Dann wird die Schicht der äußeren Längsmuskelschicht sichtbar. Ist die Grenze zwischen Längs- und Zirkularmuskulatur erreicht, wird ein Teil der enterischen Ganglien betrachtet. In den nächsten Abschnitten wird der Plexus myentericus sehr deutlich werden, wobei große Streifen von Ganglien in einem einzigen Abschnitt vorhanden sind. Sammeln Sie nun serielle Schnitte für die Laser-Capture-Mikrodissektion.

Kühlen Sie die PEN-Objektträger fünf bis 10 Sekunden lang im Kryostaten ab und verwenden Sie sie, um die Sektionen zu montieren. Die besten Abschnitte haben viele Neuronen und Glia. Fahren Sie nun mit dem Färben und Dehydrieren der Abschnitte fort, wie im Textprotokoll beschrieben.

Setzen Sie zur Vorbereitung eine Kartusche mit LCM-Kappen in den LCM-Mikroskoptisch ein. Laden Sie dann die Beispielfolie auf den Tisch und nehmen Sie ein Übersichtsbild der Folie auf. Identifizieren Sie die gewünschte Position für LCM und laden Sie eine Kappe auf den Objektträger.

Richten Sie dann den Infrarotlaser aus und stellen Sie die Leistung und Dauer des Lasers für einen Erfassungspunkt mit einem Durchmesser von 20 bis 30 Mikrometern ein. Skizzieren Sie als Nächstes die gewünschten Ganglien, die entnommen werden sollen. Achten Sie darauf, dass Sie innerhalb der Begrenzung des Sammelbereichs auf der Kappe bleiben, der als grüner Kreis angezeigt wird.

Für jedes der Ganglien, die durch eine UV-Schnittspur umrandet sind, stellen Sie die IR-Spots so ein, dass mindestens alle 100 bis 500 Mikrometer ein IR-Spot vorhanden ist, um sicherzustellen, dass alle Ganglien gesammelt werden, wenn die Kappe von der Probe abgenommen wird. Drücken Sie dann die Taste IR-UV-Schnitt, um mit der Sammlung aller markierten Ganglien fortzufahren. Sobald die Entnahme abgeschlossen ist, verschieben Sie die Kappe an einen neuen Ort und wiederholen Sie den Entnahmevorgang.

Dies kann 60 bis 80 Minuten lang wiederholt werden. Wenn die LCM-Kappe mit genügend Ganglien beladen ist, bringen Sie sie zu einer Qualitätskontrollstation. Wenn sich Schmutz auf der Kappe befindet, wischen Sie ihn mit einem feinen Pinsel ab, der für die Verwendung von RNA vorbereitet wurde.

Verwenden Sie eine Pipettenspitze für schwer zu entfernende Ablagerungen. Befestigen Sie dann die Kappe auf einem 0,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen, das mit 230 Mikrolitern RNA-Lysepuffer gefüllt ist. Drehen Sie die Kappe um, wirbeln Sie sie kurz vor und inkubieren Sie die Probe dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Später zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 5.000 g oder schneller und überführen Sie das Mikrofugenröhrchen dann in Trockeneis. Die Probe ist nun bereit für die RNA-Extraktion. Beim Ziehen von zwei Kappen enterischer Ganglien pro Probe wurde mehr als ein Nanogramm RNA erhalten, genug für RNA-Seq, und die RNA war von ausgezeichneter Qualität.

Die RNA-Integrität der gezeigten Probe beträgt 8,3. Es wurden auch Proben mit Integritätszahlen von 7,5 und 6,9 entnommen. Insgesamt waren mehr als 95% aller vorbereiteten Proben gut genug für RNA-Seq.

Die Qualität der RNA-Seq-Datensätze wurde mit Hilfe einer bioinformatischen Pipeline bewertet. Die Endverzerrung zeigt an, dass die Proben erfolgreich sequenziert wurden und nur eine bescheidene Vorspannung von drei Primzahlen aufwiesen. Ein Gen-Biotyp-Diagramm zeigt, dass die Sequenzierungsergebnisse weitgehend konsistent waren.

Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um biologische Replikate von RNA aus enterischen Ganglien von ausreichender Qualität und Quantität für RNA-Seq in nur acht bis 12 Stunden zu sammeln. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, dass die menschlichen Darmproben so flach wie möglich eingefroren werden. Dadurch wird sichergestellt, dass Sie sehr große Querschnitte von menschlichen enterischen Ganglien sammeln können, die schnell und einfach mit der Laser-Capture-Mikrodissektion bearbeitet werden können.