Vorbereitung von rhythmisch-Active In Vitro neonatale Nagetier Hirnstamm-Rückenmark und dünne Scheibe

Diese Methode erleichtert die reproduzierbare Zerlegung und Zerlegung von Nagetier-Gehirnstämmen für die erfasste Analyse des Mirian Medullary Respiratory Network. Diese Technik bietet eine große experimentelle Flexibilität, die es ermöglicht, entweder eine In-vitro-Entsperrung oder eine Scheibenvorbereitung für die Aufnahme vorzubereiten. Diese Methode kann für elektrophysiologische Experimente verwendet werden, um den neuronalen Kontrollkreislauf zu erforschen, der Atemrhythmen erzeugt, und um die Pathologie und Desregulation der Atmung bei genetisch veränderten Nagetieren zu verstehen.

Nach der Zerlegung der Neuraxis den isolierten Stamm des Tieres schnell in eine belüftete Sezierkammer unter einem Seziermikroskop übertragen und das Gewebe dorsal seit oben platzieren, wobei das rostrale Ende nach vorne der Kammer liegt. Stecken Sie das Gewebe an den Schultern und das kaudalste Ende des Rückenmarks und machen Sie einen mittelsagittalen Schnitt durch den Schädel nach der parietalen Naht, um zu vermeiden, dass der Kortex und der Hirnstamm, der dem Schädel zugrunde liegt, beschädigt werden. Beginnend an der sagittalen Naht und seitlich arbeiten, schnippeln Sie die okzipitalen Nähte des Schädels, um Knochenklappen zu schaffen, die reflektiert und angeheftet werden können, um den rostralen Teil des Schädels zu verankern und zu stabilisieren.

Nachdem Sie beide Schädelklappen reflektiert haben, verbrauchen Sie den Rest der Großhirnrinde, sodass der kaudale Teil des Kleinhirns relativ intakt bleibt, um eine dorsale Laminektomie durchzuführen. Verwenden Sie Mikrofederschere und Zangen, um die Muskulatur um den Schädel und die Wirbelsäule zu entfernen. Entfernen Sie das Gewebe entlang der Dorsalseite des Brustkorbs, so dass die Rippen intakt bleiben und schnipsen Sie vorsichtig die seitlichen Prozesse der Wirbellamina.

Nach dem Abschneiden von Geweben, die die Pons und Medulla überlagern, werden die Vermis, Kleinhirn, Pons und der Beginn des Rückenmarks deutlich sichtbar sein. Um eine ventrale Laminektomie durchzuführen, legen Sie das Gewebe dorsal-Seite nach unten und Pin an der Brustkorb und das kaudalen Ende der Wirbelsäule. Verwenden Sie die Schädelklappen, um die Rostralseite des Gewebes festzuhalten und die ventrale Hälfte des Brustkorbs, einschließlich des Brustbeins und aller Bauchorgane, zu entfernen.

Sezieren Sie das Am Brustkorb befestigte Weichgewebe, um die Rippen und das Rückenmark freizulegen, und entfernen Sie die Zunge, Speiseröhre, Luftröhre, Kehlkopf und alle anderen Weichgewebe und Muskulatur, die die Schädelbasis und die Wirbelsäule überlagern. Um die harte Palette zu identifizieren, sezieren Sie das Gewebe, das diese rechteckige Knochenplatte an der Schädelbasis überlagert, die einen V-Förmigeneinzug enthält. Dann entlang der Mittellinie der Palette schneiden, vorsichtig das Gewebe nach oben heben und einen Querschnitt durchführen, um es zu entfernen.

Um eine ventrale Laminektomie zu beginnen, entfernen Sie die Lamina, indem Sie die ventrale Oberfläche des Hirnstamms und des Rückenmarks vom ersten Halswirbel bis etwa zum Brustwirbel sieben aussetzen und fünf bis zehn Millimeter entlang der beiden Seiten der Wirbelsäule an der Lamina schnipsen. Wenn das Rückenmark freigelegt wurde, schnippeln Sie die Wurzeln etwa 20 bis 25 Millimeter bilateral, entlang der Wirbelsäule auf etwa T7 und heben Sie vorsichtig die rostrale Kante von C1, C2 und C3 mit hakenden oder gebogenen Zangen an, um das Schnippeln unter dem Knochen zur Entfernung der drei Wirbel zu ermöglichen. Wenn die gewünschte Länge des Rückenmarks von der Wirbelsäule isoliert wurde, machen Sie einen Querschnitt, um das Rückenmarksgewebe zu entfernen.

Nach dem Entfernen der Dura, legen Sie das Hirnstamm in der Mitte der Paraffin-Plattform auf den Kunststoff-Schneidblock und verwenden feine Insektenstifte, auf nicht mehr als einen Zentimeter Länge getrimmt, um das kaudale Ende des Hirnstamms durch das distale Rückenmark zu heften. Richten Sie dann den paraffinbedeckten Schneidblock mit dem gepinnten Hirnstamm im Vibratone-Blockhalter aus, so dass die Klinge senkrecht zur rostralen Fläche des Hirnstamms schneidet. Als nächstes machen Sie eine erste Scheibe, um 200 bis 300 Mikrometer ungleichmäßiges Fremdgewebe am rostralsten Ende des Gewebes zu entfernen, und nehmen Sie bei Bedarf kleine Anpassungen vor, um PARP-Linearität und kleine Schnitte zu gewährleisten, um ungleichmäßiges Gewebe zu entfernen.

Die Glossopharyngeal-Rootlets werden am seitlichen Rand des Hirnstamms sichtbar, schneiden eine 300 bis 500 Mikrometer große Scheibe Hirnstamm aus diesen rostralen neuroanatomischen Markern, um den Pre-Botzinger-Komplex und die damit verbundene Übertragungsschaltung zu erfassen. Alle Schritte des Schneidverfahrens sind entscheidend für die Schaffung einer reproduzierbaren, lebensfähigen Scheibe, mit allen notwendigen neuronalen Schaltkreisen in der richtigen Ausrichtung, um einen robusten Rhythmus zu erzeugen. Mit dieser Methode können alle minimal notwendigen neuronalen Schaltkreise zur Erzeugung und Übertragung des inspiratorischen Rhythmus in einer dünnen Scheibe erfasst werden.

Einschließlich des vorbotzinger-Komplexes, der prämotorischen Neuronen, die auf die hypoglossalen motorischen Neuronen und die hypoglossalen Nervenwurzeln projizieren. Der Präbotzinger-Komplex, die hypoglossalen oder 12. Schädel-Nervenwurzel und die C4-Nervenwurzeln können dann zur inspiratorischen Aufnahme verwendet werden. Der Schlüsselaspekt dieses Verfahrens ist die sorgfältige Isolierung der Rootlets und die Bestätigung, dass der Hirnstamm nicht beschädigt wird, bevor die letzte Scheibe geschnitten wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können elektrophysiologische Aufnahmen mit Patch-Clamp-Methoden, zusätzlichen zellulären Aufzeichnungen oder Saugelektroden gemacht werden, um die vom Netzwerk erzeugte elektrische Aktivität aufzuzeichnen. Zuvor veröffentlichte Protokolle haben wenig Schritt-für-Schritt-Details geliefert, was es für neue Forscher schwierig macht, diese Methode zu verwenden, ohne in ein anderes Labor zu reisen und Zeit mit einem erfahrenen Forscher zu verbringen.