Ein Ansaugsystem für gruppierte Spaltöffnungen durch Zucker Lösung eintauchen Behandlung in Arabidopsis Thaliana Sämlinge
15. Februar 2019
Das Ziel dieses Protokolls ist zu zeigen, wie induzieren gruppierte Spaltöffnungen in Keimblätter von Arabidopsis Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer zuckerhaltigen Lösung für mittlere und intrazelluläre Strukturen wie Chloroplasten beobachten und Mikrotubuli in der gruppierten Schließzellen mit konfokale laser-Mikroskopie.
Diese Methode hat eine Schlüsselfrage der Pflanzenentwicklungsbiologie beantwortet. Das heißt, welche Bedeutung hat die räumliche Verteilung von Stomata? Unser Induktionssystem für geclusterte Stomata mit Saccharoselösung ist ziemlich einfach und direkt auf transgene oder mutierte Linien von Arabidopsis thaliana anwendbar.
Zunächst 1,1 Gramm Murashige-Skoog-Mittelsalze und 15 Gramm Saccharose zu einem Becher geben. 490 Milliliter destilliertes Wasser in den Becher geben und mit der Rührstange vermischen. Verwenden Sie Kaliumhydroxid, um den pH-Wert auf 5,8 einzustellen.
Anschließend die Lösung mit 500 Milliliter n. Wasser verdünnen und die verdünnte Lösung in eine mittlere Flasche geben. Danach autoklavieren Sie die Lösung. Bereiten Sie die Sterilisationslösung entsprechend dem Textprotokoll vor.
Dann, unter aseptischen Bedingungen arbeiten, legen Sie etwa 50 transgene A.thaliana Samen mit einem fluoreszierenden Marker in eine 1,5 Milliliter-Röhre. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter 70% Ethanol in die Röhre und mischen, indem Sie das Rohr fünfmal invertieren. Nachdem Sie die Samen auf den Boden der Röhre sinken lassen, entfernen Sie das Ethanol vorsichtig mit einer Mikropipette.
Fügen Sie den Samen einen Milliliter Sterilisationslösung hinzu und kehren Sie die Röhre fünfmal um, um sie zu mischen. Entfernen Sie die Sterilisationslösung vorsichtig mit einer Mikropipette aus den Samen. Dann fügen Sie einen Milliliter steriles Wasser hinzu.
1,5 Milliliter der Murashige-Skoog-Lösung zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzufügen. Dann fügen Sie zwei sterilisierte Samen zu jedem Brunnen. Mit zwei Schichten Parafilm, band den Deckel auf die Platte.
Als nächstes übertragen Sie die Platte in eine Wachstumskammer, um sie für 14 Tage zu inkubieren. Zuerst übertragen Sie 30 Mikroliter Murashige-Skoog-Lösung von der 24 Well-Platte in die Mitte einer Glasrutsche. Entfernen Sie das Cotyledon mit einer Sezschere von einem 14 Tage alten Sämling.
Schwimmen Sie das Kotyledon mit der Beobachtungsseite nach oben auf den Tropfen der Murashige-Skoog-Lösung. Bereiten Sie das Kotyledon gemäß den zuvor im Journal of Visualized Experiments beschriebenen Methoden vor. Stellen Sie die Probe auf die Stufe eines konfokalen Lasermikroskops.
Verwenden Sie schließlich die helle Feldbeleuchtung, um gruppierte Schutzzellen für die Beobachtung auszuwählen. In diesem Protokoll wurde stomatale Clusterbildung bei A.thaliana Sämlingen induziert. Die in der Saccharose angebauten Wachzellen mit größeren Chloroplasten als Schutzzellen, die unter saccharosefreien Bedingungen angebaut werden.
Die Vergrößerung der Chloroplasten wurde mit einem Chloroplasten-Stroma-Marker und Chlorophyll-Autofluoreszenzen bestätigt, was darauf hindeutet, dass die Saccharosebehandlung zu einer Stärkekornansammlung in den Chloroplasten führte. Zusätzlich ergab die konfokale Beobachtung der GFP-Wanne-6, dass die kortikalen Mikrotubuli in den saccharosebehandelten Zellen radial ausgerichtet waren, genau wie in den saccharosefreien Schutzzellen. Eigentlich haben wir diese Methode zufällig entdeckt.
Nach dem Fund untersuchten wir die Umweltreaktion von clustered stomata. Wir glauben, dass unser System helfen könnte, die Bedeutung der Stomata-Verteilung zu untersuchen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt, wie man die Bildung von Haufungen von Spaltöffnungen in den Keimblättern von Arabidopsis thaliana-Sämlingen mithilfe eines zuckerhaltigen Mediums induziert. Außerdem wird die Beobachtung intrazellulärer Strukturen wie Chloroplasten und Mikrotubuli in Schließzellen mittels konfokaler Laser-Mikroskopie erläutert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenentwicklungsbiologie
- Spaltöffnungsfunktion
- Mikroskopietechniken
Hintergrund
- Stomata spielen eine entscheidende Rolle beim Gasaustausch und der Wasserregulierung in Pflanzen.
- Die räumliche Verteilung der Stomata beeinflusst die Pflanzenphysiologie und -entwicklung.
- Arabidopsis thaliana ist ein Modellorganismus zur Untersuchung der Pflanzenbiologie.
- Die konfokale Laser-Mikroskopie ermöglicht eine detaillierte Beobachtung zellulärer Strukturen.
Zweck der Studie
- Induktion von klumpenförmig angeordneten Spaltöffnungen in Keimlingen von Arabidopsis thaliana.
- Untersuchung der intrazellulären Strukturen in Schließzellen.
- Bereitstellung einer Methode, die auf transgene oder mutante Linien anwendbar ist.
Verwendete Methoden
- Herstellung eines zuckerhaltigen Mediums unter Verwendung von Murashige-Skoog-Salzen und Saccharose.
- Einstellung des pH-Werts auf 5,8 mit Kaliumhydroxid.
- Behandlung von Sämlingen durch Einweichen in das hergestellte Medium.
- Beobachtung der Spaltöffnungszellen mittels konfokaler Laser-Mikroskopie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Induktion von Haufenstomata in den Keimblättern.
- Visualisierung von Chloroplasten und Mikrotubuli in Schließzellen.
- Nachgewiesene Anwendbarkeit auf verschiedene Arabidopsis-Linien.
- Gewonnene Erkenntnisse zur räumlichen Verteilung von Stomata.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ist wirksam zur Untersuchung der Spaltöffnungsentwicklung.
- Sie vertieft das Verständnis der Spaltöffnungsfunktion in Pflanzen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesem Protokoll aufbauen, um weitere Erkenntnisse zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Das Verständnis der räumlichen Verteilung von Spaltöffnungen liefert Grundlagen für Vorhersagemodelle zur Wassernutzungseffizienz und photosynthetischen Kapazität von Pflanzen, was für die Optimierung des Ertrags und der Belastungsresistenz in der landwirtschaftlichen Biotechnologie von Bedeutung ist. Dieses Induktionssystem ermöglicht die mechanistische Untersuchung der Biologie der Schließzellen ohne genetische Modifikation und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in pflanzlichen Signalwegen. Die Methode bietet eine skalierbare und reproduzierbare Plattform zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Spaltöffnungsmusterung und -funktion in Entdeckungsplattformen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung räumlicher Musterbildungsmechanismen in der Spaltöffnungsentwicklung, um Zielstrukturen in pflanzlichen Signalwegen zu validieren.
- Operativer Wert: Bietet ein nicht-genetisches, chemisch induzierbares System, das auf transgene oder mutante Linien anwendbar ist, um Risiken bei Zielstrukturen zu minimieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare phänotypische Ausgaben (geclusterte Stomata, Vergrößerung der Chloroplasten) für die Hochdurchsatz-Screening-Analyse bioaktiver Verbindungen.
- Operativer Wert: Verwendet standardisiertes Sucrose-MS-Medium und konfokale Messungen, um die Reproduzierbarkeit des Assays zwischen verschiedenen Laboratorien sicherzustellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet die Stomata-Anhäufung mit intrazellulären Biomarkern (Chloroplasten-Größe, Mikrotubuli-Orientierung) zur mechanistischen Risikominimierung bei Studien zur Pflanzen-Stressantwort.
- Operativer Wert: Unterstützt die Kontinuität von der Gen-/Target-Entdeckung bis zur phänotypischen Validierung in krankheitsrelevanten Systemen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in frühe Entdeckungsworkflows, bei denen phänotypische Screening-Verfahren und Zielvalidierung der Identifizierung von Leitstrukturen vorausgehen, insbesondere in Entwicklungsabläufen für Agrochemikalien und Pflanzeneigenschaften.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt Hypothesentests zur Bedeutung des Spaltöffnungsabstands durch induzierbare Clusterbildung ohne genetische Veränderung.
- Screening: Ermöglicht assaysbereite Systeme mit quantifizierbaren Merkmalen der Schließzellen für die Durchmusterung von Substanzbibliotheken.
- Analytik: Bietet quantitative konfokale Messgrößen (Chloroplastengröße, Mikrotubuli-Orientierung), um Behandlungseffekte zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet intrazelluläre Beobachtungen mit der Spaltöffnungsfunktion für die Vorhersagemodellierung von Stressreaktionen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Induktionsplattform, die auf verschiedene mutante und transgene Arabidopsis-Linien anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung durch phänotypische Entlastung von Stomata-Musterbildungsmechanismen.
- Operationaler Wert: Standardisierung durch definiertes Sucrose-MS-Medium und pH-Anpassung gewährleistet Reproduzierbarkeit.
- Strategischer Wert: Ermöglicht frühzeitige Go/No-Go-Entscheidungen bezüglich Verbindungen, die die Stomataentwicklung beeinflussen, und verringert das Risiko spätzeitiger Fehlschläge.
- Portfolio-Wirkung: Erleichtert die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf phänotypischer Validierung in Systemen mit gehäuften Stomata.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Pflanzengewebekultur, steriler Technik und konfokaler Mikroskopie.
- Setzt Zugang zu einem Autoklaven, Wachstumskammern und Laserscanning-Mikroskopen voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Samensterilisierung und der Zubereitung des Saccharose-Mediums zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen.
- Die Übertragung auf andere Arten oder Gewebetypen kann eine Optimierung der Saccharosekonzentration und der Einwirkdauer erfordern.
- Beschränkt auf beobachtbare Phänotypen in den Keimblättern; die Übertragbarkeit auf Ganzpflanzenanalysen könnte zusätzliche Validierung benötigen.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:31
Preparation of 3% Sucrose Containing 1/2 Murashige-Skoog Medium Solution
1:12
Induction of Clustered Stomata by Sucrose-containing Medium Solution Immersion Treatment
2:30
Microscopic Observation of Clustered Stomata
3:15
Stomata Clustering Induced in A. thaliana Seedlings
4:06
Conclusion
