Mikroelektroden-Impalement-Methode zur Aufzeichnung des Membranpotenzials aus einer kantigen mittleren Zerebralparese

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um das Membranpotenzial normaler und kranker Blutgefäße zu messen und pharmakologische Wirkstoffe zu bewerten, die das Membranpotenzial, den Gefäßton ustonieren und den Blutfluss modulieren. Die aus dieser Technik erzeugten Membranpotentiale liegen nahe am physiologischen Bereich, da sich die geglätteten Gefäßmuskeln in einem Synzytium befinden. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, platzieren Sie einen Zweikanal-Differentialelektrometerverstärker in der Nähe der Gefäßkammer an der gewünschten Stelle.

Verwenden Sie ein BNC-BNC-Kabel, um den Ausgang des Verstärkerkanals A oder B mit dem Kanaleingang des Digitizers zu verbinden. Montieren Sie die Sonde im Mikromanipulator, und drehen Sie den Mikromanipulator in Richtung Mikroskop und Myograph auf einem vibrationsfreien Tisch. Platzieren Sie die Knöpfe und Schalter an der Vorderseite des Verstärkers in den entsprechenden Positionen für das Experiment, wie im Handbuch beschrieben.

Schließen Sie dann den Badegrund mit einer geeigneten Elektrode an den Schaltboden des Verstärkers an und stellen Sie sicher, dass der Käfig an das Gehäuse des Verstärkers geerdet ist. Um die Borosilikatglas-Mikroelektroden vorzubereiten, verwenden Sie einen Standard-Zieher, um eine kurze, allmähliche, acht- bis 10-Millimeter-Verjüngung mit einem Durchmesser von weniger als einem Mikrometer zu erreichen, die zweimal für höhere Widerstände und kleinere Spitzen schleift. Verwenden Sie eine Mikrofaserspritze, um die Mikroelektrode mit dreimolarem Kaliumchlorid zu füllen, wobei der Kolben während der Injektion langsam zurückgezogen wird, um Platz für die Flüssigkeit zu geben und die Bildung von Blasen innerhalb der Mikroelektrode zu verhindern.

Legen Sie die voll belastete Mikroelektrode auf den Mikroelektrodenhalter und drücken Sie den Elektrodenschaft vorsichtig, aber fest durch das Bohrloch in den Halter. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Laborgewebe, und schließen Sie die Elektrodenhalterbaugruppe an die Verstärkersonde an. Führen Sie einen Elektrodentest durch, um den Elektrodenwiderstand zu messen.

Öffnen Sie dann die Aufnahmesoftware, weisen Sie der Datei einen Namen zu, und speichern Sie die Datei für die zukünftige Analyse. Als nächstes spülen Sie die Myographenkammer mehrmals mit destilliertem Wasser ab, bevor Sie die Kammer mit fünf Millilitern normaler physiologischer Salzlösung oder PSS beladen. Füllen Sie mit einer Fünf- oder 10-Milliliter-Spritze sowohl Glaskanülen als auch die angeschlossenen Schläuche mit gefiltertem normalen PSS, ohne Luftblasen einzuführen, und verwenden Sie stumpfe Zangen, um einen halben Knoten in zwei 10-0 Monofilament Nylon-Nähten herzustellen.

Dann, mit Sezierzangen unter einem Seziermikroskop, legen Sie die teilweise geschlossenen Nahtknoten auf beiden Kanülen leicht weg von den Spitzen. Für die mittlere Zerebralparese Isolation, verwenden Federschere und Zange, um zu identifizieren und zu sezieren ein unverzweigtes Segment der mittleren Zerebrale Arterie, mit einem Innendurchmesser von 100 bis 200 Mikrometer, der Ratte Gehirn. Verwenden Sie feine Zangen, um die mittlere Zerebrale arterienweise auf die Glaskanülen zu montieren, und ziehen Sie die Nähte, um die Arterie an der Kanüle zu sichern.

Schließen Sie die distale Kanüle, damit es keinen Fluss innerhalb der Arterie gibt, und schließen Sie die Zuflusspipette an ein PsS-Reservoir an. Visualisieren Sie die kanülierte mittlere Hirnarterie mit einer ladungsgekoppelten Gerätekamera, die auf einem invertierten Mikroskop und einer Bildgebungssoftware montiert ist. Stellen Sie die axiale Länge des MCA auf eine ungefähre Länge ein, sodass sie weder starr noch schlaff erscheint.

Die Badlösung mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius ausdemieren. Tauchen Sie den Boden des Verstärkers in die PSS des Myographen ein. Beleuchten Sie die Gefäßkammer und visualisieren Sie die Spitze der Mikroelektrode in der Badlösung durch das Mikroskop.

Bewegen Sie mit dem Mikromanipulator die Spitze der Mikroelektrode in der Nähe der Außenwand des Blutgefäßes, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung. Bewegen Sie langsam die Spitze der Mikroelektrode in Richtung des Schiffes, das auf die Mitte des Gefäßes zielt. Wenn die Spitze in unmittelbarer Nähe zum Gefäß kommt, bringen Sie die Elektrode in einer schnellen Bewegung vorwärts, um die Membran des Muskels zu aufpalest.

Sobald die Membran durchdrungen ist, können Veränderungen des Membranpotentials beobachtet werden. Berühren Sie den Mikromanipulator nicht, sobald die Membran aufgespießt wurde. Wenn die Membranmögliche Veränderungen aufgezeichnet wurden, verwenden Sie den Manipulator, um die Mikroelektrode in einer schnellen Bewegung zu entfernen, und stoppen Sie die Aufzeichnung, bevor Sie die Datendateien speichern.

Impalement gilt als erfolgreich, wenn es eine schnelle Ablenkung zu negativen Werten gibt, das Membranpotential für mindestens 30 Sekunden stabil ist und die Spannung bei Entfernung der Elektrode abrupt auf null Millivolt zurückkehrt. Nach einer erfolgreichen Präsment- und Membranpotentialstabilisierung können Medikamente von Interesse in das Bad durchdrungen und Veränderungen des Membranpotentials aufgezeichnet werden. In diesem repräsentativen Experiment depolarisierte die Perfusion mit Kaliumchlorid die Membran um etwa sechs Millivolt, während die Perfusion mit einem kalziumabhängigen Aktivator großer Leitfähigkeit Calcium-aktivierte Kaliumkanäle die Membran um fast vier Millivolt hyperpolarisierte.

Das Wichtigste, was Sie sich merken sollten, ist, hochresistente Mikroelektroden zu ziehen, die eine kurze, allmähliche Verjüngung mit einem Durchmesser von weniger als einem Mikrometer haben.