Konfokale Abbildung von Double-Stranded RNA und Muster Anerkennung Rezeptoren im negativen Sinn-RNA-Virusinfektion
26. Januar 2019
Doppelsträngige RNA produziert während der RNA-Virus-Replikation man Muster Anerkennung Rezeptoren erkennt an eine angeborene Immunantwort zu induzieren. Für negativ-Sense-RNA-Viren bleibt die Interaktion zwischen dem Low-Level-DsRNA und PRRs unklar. Wir haben eine Methode konfokalen Mikroskopie Arenavirus DsRNA und PRR in einzelnen Zellen visualisieren entwickelt.
Herkömmliche Doppelstrang-RNA-Detektionstest ist in der Regel nicht empfindlich genug, um Doppelstrang-RNA zu erkennen, die in einer negativ-sinnlichen RNA-Virusinfektion gebildet wird. Daher ist die Wechselwirkung zwischen doppelsträngiger RNA und Hostmustererkennungsrezeptoren für diese Viren weitgehend schwer fassbar. Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, die Wechselwirkung zwischen viralem Kernprotein, Doppelstrang-RNA zu visualisieren und zu charakterisieren und eine PRRs auf einzelliger Ebene für negativ-sinnliche RNA-Viren zu hosten. Dies ist ein Multiplex-Assay, der die gleichzeitige Färbung von doppelsträngiger RNA und zwei viralen oder Hostprotein-Targets in einzelnen Zellen ermöglicht. Im Gegensatz zum RNA-FISH-Assay ist diese Technik RNA-sequenzunabhängig und in der Regel mit dem Antikörpernachweis von Proteinzielen kompatibel. Beginnen Sie 24 Stunden vor der Infektion, indem Sie 200. 000 menschliche Lungenepithel-A549-Zellen auf poly-D-Lysin beschichtete Glasabdeckungen in 12-Well-Platten aussäen und mit 37 anbauen.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Erkennung von doppelsträngiger RNA (dsRNA), die während der Replikation von RNA-Viren durch Erkennungsrezeptoren für Mustermuster (PRRs) gebildet wird, um eine angeborene Immunantwort auszulösen. Der Fokus liegt auf RNA-Viren mit negativer Polarität, bei denen die Interaktion zwischen geringen Mengen an dsRNA und PRRs noch nicht gut verstanden ist. Es wurde eine Methode der konfokalen Mikroskopie entwickelt, um die dsRNA von Arenaviren und PRRs in einzelnen Zellen sichtbar zu machen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Virologie
Hintergrund
- Doppelsträngige RNA ist ein Nebenprodukt der Replikation von RNA-Viren.
- Erkennungsrezeptoren für molekulare Muster spielen eine entscheidende Rolle bei der angeborenen Immunantwort.
- Die Interaktion zwischen dsRNA und PRRs bei RNA-Viren mit negativer Polarität ist bisher nur unzureichend verstanden.
- Die Visualisierung von dsRNA und PRRs kann das Verständnis der viralen Immunflucht verbessern.
Zweck der Studie
- Aufklärung der Interaktion zwischen dsRNA und PRRs bei RNA-Viren mit negativer Polarität.
- Entwicklung einer Methode zur Visualisierung dieser Interaktionen in einzelnen Zellen.
- Beitrag zum Verständnis der angeborenen Immunantwort auf RNA-Viren.
Verwendete Methoden
- Konfokale Mikroskopie zur Visualisierung von dsRNA und PRRs.
- Zelluläre Assays zur Beurteilung der Immunantwort.
- Analyse der dsRNA-Spiegel während der viralen Replikation.
- Vergleichende Studien mit verschiedenen RNA-Viren.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von Arenavirus-dsRNA und PRRs in einzelnen Zellen.
- Identifizierung spezifischer Interaktionen zwischen dsRNA und PRRs.
- Erkenntnisse über die durch dsRNA ausgelösten Mechanismen der Immunantwort.
- Klärung der Rolle von dsRNA bei der viralen Pathogenese.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Konfokalmikroskopiemethode eignet sich effektiv zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen dsRNA und PRR.
- Das Verständnis dieser Wechselwirkungen könnte zu neuen therapeutischen Strategien gegen RNA-Viren führen.
- Diese Forschung leistet einen Beitrag zum weiteren Gebiet der viralen Immunologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Visualisierung von selten vorkommenden doppelsträngigen RNA-Molekülen (dsRNA) bei Infektionen mit negativ-sinniger RNA-Viren schließt eine entscheidende Wissenslücke im Verständnis der Aktivierung der angeborenen Immunität und der viralen Immunflucht. Diese Fähigkeit unterstützt die Validierung von Zielstrukturen und die mechanistische Absicherung in der antiviralen Wirkstoffforschung, indem sie die direkte Beobachtung der Bindung von Pathogen-erkennenden Rezeptoren (PRR) an virale Replikationsintermediate ermöglicht. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit bei der frühen Auswahl von Zielstrukturen für Arenaviren und verwandte Erreger und trägt so zur Priorisierung von Forschungsportfolios in Programmen mit hochpathogenen Erregern bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen dsRNA und PRR auf Einzelzell-Ebene in pathogenen Virusmodellen.
- Operationaler Wert: Bietet ein empfindliches, sequenzunabhängiges Nachweisverfahren, das mit multiplexierter Proteinanfärbung zur Aufklärung von Signalwegen kompatibel ist.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die biologische Entschärfung von PRR-Zielen, indem die Ligandenbindung in relevanten Infektionskontexten bestätigt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt quantitative, räumlich aufgelöste Nachweise der Kolokalisation von dsRNA und PRR zur Standardisierung von Assays.
- Eignung für die Bildschirmanalyse: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening-Analyse vor, indem Baseline-Metriken der Immunaktivierung etabliert werden.
- Plattformtauglichkeit: Kompatibel mit antikörperbasierten Nachweismethoden, wodurch eine Wiederverwendung über virale Zielstrukturen und Wirtseigene Proteine hinweg in bildgebenden Workflows ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungsbeobachtungen mit der präklinischen Validierung, indem die Verteilung von dsRNA und die Rekrutierung von PRRs in krankheitsrelevanten Systemen abgebildet werden.
- Mechanistische Erkenntnisse: Klärt die räumlichen und zeitlichen Dynamiken der angeborenen Immunsignalgebung und unterstützt die Auswahl von Biomarkern zur Modulation des Signalwegs.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht datengestützte Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf visueller Bestätigung der Zielinteraktion in Modellen mit hoher Pathogenität.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Zielhypothesen über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Validierung ein, insbesondere für immunmodulatorische Antiviretika, die auf PRR-Signalwege abzielen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von PRR-Agonisten/Antagonisten-Mechanismen durch Visualisierung von dsRNA als endogenem Liganden in infizierten Zellen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Bildgebungsdaten, die den Vergleich der Wirkstoffeffekte auf dsRNA-PRR-Wechselwirkungen ermöglichen.
- Analytik: Bietet multiplexe Fluoreszenzsignale (dsRNA, virales Protein, PRR) für die hochinhaltsbasierte Analyse von Immunaktivierungszuständen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Beobachtungen mit der präklinischen Kontinuität, indem die PRR-Aktivierung in primären oder aus Stammzellen abgeleiteten Lungenepithelmodellen bestätigt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte Bildgebungsplattform, die auf mehrere RNA-Viren mit negativem Sinn und Wirtziele jenseits der Arenaviren anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem die mechanistische Mehrdeutigkeit bei PRR-Ligand-Wechselwirkungen verringert wird.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Assays durch standardisierte konfokale Protokolle und empfindliche Nachweise doppelsträngiger RNA.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen, indem direkte visuelle Nachweise der Signalwegmodulation bereitgestellt werden und späte Ausscheidungen reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung immunmodulatorischer Kandidaten basierend auf nachgewiesener Zielinteraktion in pathogenen Viruskontexten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in konfokaler Mikroskopie, Immunfluoreszenz-Färbung und virologischen Techniken auf dem entsprechenden Biosicherheitsniveau.
- Hängt vom Zugang zu hochsensitiven Antikörpern gegen dsRNA (z. B. Klon 9D5) und kompatibler Fluoreszenz-Bildgebungstechnik ab.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen verschiedenen Laboren, um eine konsistente Quantifizierung des dsRNA-Signals und Analysen zur Kolokalisation zu gewährleisten.
- Muss die Variabilität des Zellmodells (z. B. A549 im Vergleich zu primärem Atemwegsepithel) hinsichtlich der dsRNA-Produktion und der Expression von PRR berücksichtigen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören mögliche Antikörper-Kreuzreaktivitäten und die Notwendigkeit der Optimierung unter Bedingungen hoher Sicherheitsstufen (BSL-3/BSL-4).
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Preparation of A549 Cells and JUNV (Junn virus) Infection
2:09
Fixation and Immunostaining
5:10
Results: Distribution and Colocalization Between the Retinoic Acid Like Receptors RLRs (RIG-I and MDA-5) and dsRNA in JUNV-infected Cells
5:52
Conclusion
