Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Dieses reproduzierbare und einfach durchzuführende Protokoll verwendet eine Ex-vivo-Lymphknoten-Bildgebungsstrategie, um die Entwässerung von in-vivo verabreichten fluoreszierenden markierten Antikörpern an lokale sekundäre Lymphoidorgane zu verfolgen. Die Demonstration dieser Technik ermöglicht eine spezifische Visualisierung der Prozedur, was eine erfolgreiche Ausführung des Protokolls erleichtern kann. Dies ist eine sehr einfache und unkomplizierte Technik, die von jedem durchgeführt werden kann.

Der einzige herausfordernde Aspekt ist die Maushandhabung, die einiges Training erfordert. Diese Technik hat den Vorteil einer verbesserten Geschwindigkeitsgewebebelastungundung und Zelllebensfähigkeit im Vergleich zu herkömmlichen fluoreszierenden Färbungsmethoden. Ausbildung des Verfahrens wäre Bruna Tatematsu, eine Technikerin aus dem Labor.

Verdünnen Sie die Mitstoffe von Interesse, konjugiert zu den entsprechenden Fluorophoren, in 100 Mikroliter PBS für die Bildgebung von Leistenlymphknoten oder 50 Mikroliter PBS für die popliteale Lymphknotenbildgebung. Für die Bildgebung von Leisten-Lymphknoten 100 Mikroliter des Antikörpercocktails in eine einMilliliter-Insulinspritze laden, die mit einer 30-Meter-mal-Halbzoll-Nadel ausgestattet ist, und die Antikörper subkutan in den inneren Oberschenkel der Versuchsmaus injizieren. Zur poplitealen Lymphknotenbildgebung 50 Mikroliter des Antikörpercocktails subkutan in ein Pfotenpad des Versuchstiers injizieren.

Dann kehren Sie das Tier in seine Heimatbox zurück. Für Leistenentwässerung Lymphknoten Ernte, nach dem Warten mindestens drei Stunden von der Injektion, immobilisieren Sie die Maus auf der Acryl-Bühne mit Klebeband und wenden Sie Mineralöl auf die Bauchhaut. Verwenden Sie Standard-Mikrochirurgie-Schere und Mikrochirurgie gekrümmte Zange, um einen Mittellinien-Hautschnitt im Bauch von der Schambein-Totschlag-Prozess zu machen, und dissoziieren Sie die Bauchmuskulatur von der Haut.

Machen Sie horizontale Hauteinschnitte in der Ober- und Unterseite der vertikalen Schnittlinie, um Hautklappen an der Seite der Injektion zu erstellen, und ziehen Sie die Haut zurück, um den Lymphknoten zu visualisieren. Sichern Sie die Hautklappe an der Acrylplatte, und verwenden Sie die Zange, um den transluzenten, in der Regel zweisprachigen sphärischen Leistenabfluss-Lymphknoten zu entfernen. Für popliteale entwässernde Lymphknoten Ernte, mindestens 12 Stunden nach der Injektion, immobilisieren Sie die Maus in der anfälligen Position auf einer Acryl-Bühne.

Tragen Sie Mineralöl auf das Kalb und knie auf der injizierten Seite des Tieres auf. Als nächstes machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Wade von der Ferse bis zum Knie, und distanzieren Sie die Wadenmuskulatur von der Haut. Expose die popliteale Fossa.

Der popliteale Lymphknoten erscheint als transluzente Kugel innerhalb der Fossa. Entfernen Sie dann den Lymphknoten mit den gekrümmten Zangen der Mikrochirurgie. Um den Lymphknoten für die Bildgebung vorzubereiten, legen Sie die gesamten Organe in eine 35 mal 10 Millimeter große Kulturschale mit einem Glasboden und entfernen Sie mit Zangen das Gesamteinfett, das das Gewebe umgibt.

Zentrieren Sie das Organ in der Mitte der Schale, und bedecken Sie das Gewebe mit einem Stück salinegetränkten zarten Aufgabenwischer. Positionieren Sie die Schale für die Ex-vivo-Bildgebung im invertierten konfokalen Mikroskopschlitz und verwenden Sie das herkömmliche Licht des konfokalen Mikroskops und das 4-10X-Objektiv, um den richtigen Fokus zu erhalten. Wechseln Sie von der Lichtfunktion in den Lasermodus und verwenden Sie eine isotopbefleckte, nicht gefleckte oder nicht fluoreszierende Probe, um die Laserleistung, den Offset und die Verstärkung anzupassen, um die automatische Fluoreszenz und jede nicht spezifizierte Färbung zu entfernen.

Erfassen Sie Bilder unter den 4, 10 und den 20X-Objektiven, die sich auf die Struktur des Lymphknotens und die Zellverteilung konzentrieren und eine Definition von 1024 x 1024 Pixel verwenden. Verwenden Sie dann ein geeignetes Imaging-Analyse-Softwareprogramm, um die Kanäle zu trennen, den Maßstab und die Farben von Interesse hinzuzufügen und die 3D-Ansicht zu rekonstruieren. Die leistungsstarke Kombination von Immunolabeling von Lymphknotenzellen mit Anti-CD4- und Anti-CD19-Antikörpern und konfokaler Bildgebungsanalyse ermöglicht die Lokalisierung von T- und B-Zellen innerhalb der Leistenlymphknoten.

In den poplitealen Lymphknoten, wie im Leistengewebe, sind die B-Zellfollikel von T-Zellpopulationen umgeben, ein Kennzeichen der Lymphknotenstruktur. Wie in diesen Bildern beobachtet, verinnerlichen Phagozyten die injizierten Antikörper nicht, was darauf hindeutet, dass die B- und T-Zellfärbung spezifisch ist. Darüber hinaus weist eine Rekonstruktion der Etikettierung darauf hin, dass sich die T- und B-Zellfärbung nicht überlappen, was die Spezifität der Färbung bestätigt.

Monozelluläre Zellen werden im gesamten Leisten-Lymphknoten beobachtet, einschließlich der subkapsulären Sinus. Mit der Mehrheit der mononukleären Zellen, die CX3XR1 exdrücken, gefolgt von CCR2 und CXCR31CCR2 doppelpositive Zellen. Das gleiche Muster der Zellverteilung und Zellphänotypen wird im poplitealen Lymphknoten beobachtet.

Beide Lymphknoten weisen auch dunkle Regionen ohne mononukleäre Zellrezeptorexpression auf, die von Lymphozyten belegt sind. Darüber hinaus sind mononukleäre Zellen im inneren Bereich der Lymphknoten knapp und bleiben in den äußeren Bereichen des Gewebes konzentriert, was darauf hindeutet, dass diese Zellen in erster Linie den lymphen Knoten subkapsulären Sinus besetzen. Das Antikörpergemisch muss präzise in das Subkutangewebe injiziert werden, damit das Lymphsystem die Antikörper ordnungsgemäß an den Lymphknoten abtropfen lässt.

Diese Methode kann auf die Bioverteilung von fluoreszierenden markierten Arzneimitteln und auf Zellzielstudien von fluoreszierenden nanopartikeln Nanopartikeln angewendet werden.