Ein In-Vitro-Batch-Kulturmodell zur Abschätzung der Auswirkungen interventionaler Regimen auf humane fäkale Mikrobiota

In Anbetracht der aufkommenden Rolle des Darmmikrobioms in verschiedenen menschlichen Krankheiten, mehrere Darm-Mikrobiom-Modulatoren wie Probiotika, Präbiotika, Diäten und Medikamente können bei der Linderung von Darm-Mikrobiom-assoziierten gesundheitlichen Beschwerden helfen. Allerdings gibt es kein schnelles und erschwingliches Screening-System, um die Auswirkungen solcher Darmmikrobiom-Modulatoren vorherzusagen, aber dieses System ist einfach genug, um vorherzusagen, wie bestimmte Interventionen Darmmikrobiom beeinflussen können, die letztlich die Gesundheit des Gastgebers beeinflussen können. Dieses Protokoll ist einfach, erschwinglich und praktisch für Laboratorien, die die Darmmikrobiommodulatoren und ihre Auswirkungen auf Mikrobiota und Wirtgesundheit untersuchen.

Die Aufrechterhaltung aseptischer und anaerober Bedingungen ist für dieses Experiment von entscheidender Bedeutung. Auch die Fäkalienprobe sollte sofort nach der Entnahme neu verwendet werden. Andernfalls sollte die Probe, wenn das Experiment später geplant wird, sofort nach der Entnahme bei minus 80 gelagert werden, ohne dass Umgebungstemperatur und Luft ausgesetzt sind.

Die Handhabungsgenauigkeit beim aliquot-Prepping und Pipettieren ist auch wichtig für die Aufrechterhaltung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit. Es dauert weniger als 12 Stunden am Tag. Wir können über Nacht eine Kultur aufbauen, wenn sie die Proben in 24 Stunden benötigen.

Dann folgen die kurzkettigen Fettsäuren und die Mikrobiombestimmung. Dieser Prozess wird von zwei großen Uni-Studenten, Shokouh Ahmadi und Rabina Mainali aus meinem Labor, demonstriert. Zur Herstellung von Fermentationsmedien unter einer Dunstabzugshaube, in einer Reagenzflasche auf Magnetmischung, Mischen Vonlösung A, Lösung B, Spurenminerallösung, wasserlösliche Vitaminlösung, Folatbiotinlösung, Riboflavinlösung, Heminlösung, kurzkettige Fettsäuremischung und Resazurin.

Dann in die Flasche Hefe-Extrakt, Natriumcarbonat, Cysteinhydrochlorid-Monohydrat hinzufügen, und Trypticase. Fügen Sie 296,1 Milliliter destilliertes Wasser hinzu, stellen Sie den pH-Wert mit einem normalen Hydrochlorid oder Natriumhydroxid ein, um sicherzustellen, dass es bei 7,0 liegt. Übertragen Sie das Becherglas an einen aseptischen Arbeitsplatz und verwenden Sie einen Vakuumfilter mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern, um die Medien für die Sterilisation zu filtern.

Um einen Liter anaerobe Verdünnungslösung vorzubereiten, lösen Sie fünf Gramm Natriumchlorid, zwei Gramm Glukose und 0,3 Gramm Cysteinhydrochlorid-Monohydrat im ionisierten Wasser auf. Autoclavdiere die Reagenzflasche mit Kappe bei 121,1 Grad Celsius für 15 Minuten und lagern Sie sie in der anaeroben Kammer. Bewahren Sie vor Beginn des Fermentationsexperiments alle Materialien, Lösungen und Werkzeuge, die für das Fermentationsexperiment benötigt werden, mindestens 48 Stunden in der anaeroben Kammer auf, um sicherzustellen, dass eventuelle Rückstände entfernt werden.

Mindestens 24 Stunden vor dem Fermentationsexperiment 300 Milligramm Inulin wiegen und in eine 50-Milliliter-Röhre geben, die dann in die anaerobe Kammer gelegt wird. Fügen Sie 26 Milliliter sterilisierte Fermentationsmedien in die Röhre und Wirbel zu mischen. Hydratation der Faser für ca. 24 Stunden zulassen.

Am Tag des Fermentationsexperiments fäkales Inokulum zubereiten. Wiegen Sie zunächst fünf Gramm frischer Fäkalienprobe in einem 50 Milliliter konischen Rohr. Fügen Sie der Röhre eine anaerobe Verdünnungslösung hinzu, um ein Endvolumen von 50 Millilitern zu erreichen.

Wirbel für 15 Minuten, oder bis vollständig homogenisiert. Bewahren Sie die geimpften Rohre bei 37 Grad Celsius in der anaeroben Kammer auf und kehren Sie einmal pro Stunde sanft um, um die Fasern und das Inokulum wieder aufzuhängen. Nach drei, sechs, neun oder 24 Stunden die richtige Menge an fermentierten Medien herausnehmen und die Proben bei 14.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Sofort den Überstand und das Pellet in flüssigem Stickstoff einfrieren, dann nach dem Einfrieren des Drucks den Überstand für die Kurzkett-Fettsäurenanalyse und Pellet für die Mikrobiomanalyse bei minus 80 Grad Celsius lagern. Dieses Protokoll wird verwendet, um die Wirkung eines bestimmten Präbiotikums zu demonstrieren. Der Kot gesunder menschlicher Probanden zeigte nach der Behandlung mit Inulin neun Stunden lang einen relativ stabilen pH-Wert, während er nach 24 Stunden dramatisch sank.

Die Inokulation von Inulin erhöht signifikant den Gehalt an kurzkettigen Fettsäuren und Laktat in inulin behandelten Fäkalienproben wird mit der nicht behandelten fäkalen Mikrobiotakultur verglichen. Die Hauptkoordinatenanalyse zeigt eine unterschiedliche Mikrobiotazusammensetzung zu den gewichteten und ungewichteten UniFrac-Messungen der Beta-Diversität zwischen inulin behandelten und unbehandelten Proben. Indizes der Alpha-Vielfalt im Vergleich zur phylogenetischen Vielfalt durch PD-Gesamtbaum, Artenreichtum, operative taxonomische Einheiten, Artengleichmäßigkeit, sowie relative Fülle von großen Phyla und Gattungen, alle präsentieren verschiedene Darm-Mikrobiota-Signaturen zwischen inulin behandelten und unbehandelten Proben.

Taxonomisches Cladogramm, abgeleitet aus der linearen Diskriminanteneffektgrößenanalyse von 16S-Sequenzen, stellt die unterschiedlich reichlich vorhandenen Taxa zwischen verschiedenen Probengruppen dar. Befolgen Sie alle Schritte sorgfältig. Das Wichtigste ist, strenge aseptische und anaerobe Bedingungen beizubehalten.

Der Überstand und aus dem Experiment können verwendet werden, um Kurzkettige Fettsäuren Füllstandänderungen als Folge der Fermentation basierend auf Fasern zu behandeln. Zusätzlich kann das in der Pellet zur Analyse der Veränderungen in der Darmmikrobiomzusammensetzung verwendet werden. Einige Chemikalien, die für die Herstellung der Kulturmedien verwendet werden, sind potenziell gefährlich.

Bitte stellen Sie das MSDS-Blatt auf, und treffen Sie entsprechende Vorsichtsmaßnahmen.