Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus
24. Mai 2020
Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionsverfahren für Culex quinquefasciatus-Embryonen, die für die Arbeit mit CRISPR/Cas9-Genbearbeitungswerkzeugen optimiert sind. Diese Technik kann effizient ortsspezifische, vererbbare Keimbahnmutationen erzeugen, die für den Aufbau genetischer Technologien in diesem wenig untersuchten Krankheitsvektor verwendet werden können.
Mikroinjektionstechniken von Embryonen haben den Weg für die Entwicklung zahlreicher genetischer Instrumente zur Kontrolle von Vektoren geebnet. Obwohl die Protokolle für zahlreiche Insektenarten bereits gut entwickelt sind, ist Culex quinquefasciatus noch relativ wenig erforscht. Dieses Mikroinjektionsprotokoll wurde speziell entwickelt, um die einzigartigen biologischen Eigenschaften von Culex quinquefasciatus zu berücksichtigen, einschließlich der Eizellentnahme, der Trennung der Eiablage und der Verfahren nach der Injektion.
Diese Methode kann wahrscheinlich an jede interessierende Culex-Spezies angepasst werden und kann zur Untersuchung der Genfunktion oder zur Entwicklung genetischer Kontrolltechnologien für Culex-Arten verwendet werden. Beginne damit, die Eier von den Flößen zu trennen. Mit einer Pinzette oder einem Pinsel auf das Floß drücken und die einzelnen Eier auseinandertoupieren.
Richte die Eier auf einem dünnen Streifen doppelseitigem Klebeband aus, das oben auf einem Objektträger platziert ist, und bemühe dich, die vordere Seite jedes Eies in die gleiche Richtung zu zeigen. Bereiten Sie die Halogenkohlenwasserstoffmischung vor, indem Sie die Halogenkohlenwasserstoffreagenzien vorsichtig mit Wasser mischen und die Mischung über Nacht bei 25 Grad Celsius inkubieren. Ausgerichtete Eier mit der Halogenkohlenwasserstoff-Ölmischung bedecken.
Um Nadeln für die Mikroinjektionen zu erzeugen, setzen Sie ein Aluminiumsilikat-Kapillarglas in einen Nadelabzieher ein, wobei Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Stellen Sie die Hitze auf 560, die Geschwindigkeit auf 100, die Verzögerung auf 70, den Zug auf 97 und den Druck auf 500 ein. Aktivieren Sie dann den Nadelabzieher.
Berühren Sie die Spitze der gezogenen Nadel etwa 10 Sekunden lang vorsichtig in einem Winkel von 50 Grad auf der rotierenden Diamantschleifplatte, um die Nadelspitze abzuschrägen. Betten Sie gezogene und abgeschrägte Nadeln in Linien aus Modelliermasse in einer Petrischale ein. Bereiten Sie die Injektionsmischung bestehend aus Reagenzien zur Genommodifikation vor und lagern Sie sie auf Eis.
Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um zwei Mikroliter Injektionsmischung in die Injektionsnadel zu füllen. Legen Sie die gefüllte Injektionsnadel in einen Mikromanipulator, der mit einem elektronischen Mikroinjektor verbunden ist, und platzieren Sie den Objektträger mit den ausgerichteten Eiern auf dem Tisch eines Verbundmikroskops. Richten Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator so aus, dass sie in einem Winkel von 25 bis 35 Grad auf das hintere Ende des Embryos zielt.
Führen Sie die Nadel vorsichtig in den Embryo ein und injizieren Sie die Mischung in einer Menge von etwa 10 % des Volumens des Embryos. Injizieren Sie jeweils 20 Eizellen, stoppen Sie dann und führen Sie die Embryonenwiederherstellung durch. Entfernen Sie innerhalb von 20 Minuten nach der Injektion vorsichtig das Halogenkohlenwasserstofföl von den Eiern, indem Sie sie leicht mit einem sauberen Pinsel abbürsten.
Heben Sie die Eier mit dem Pinsel an und legen Sie sie in eine Tasse mit doppelt destilliertem Wasser, wobei Sie darauf achten, dass die Eier an der Oberfläche bleiben. Kontrollieren Sie in den nächsten sieben Tagen täglich die Eier auf das Schlüpfen und befolgen Sie die normalen Verfahren zur Larvenaufzucht. Untersuchen Sie die injizierten Mücken mit einem Stereoskop auf die mutierten Phänotypen.
Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um somatische und Keimbahnmutationen eines Gens zu erzeugen, das für die Entwicklung der Pigmentierung des dunklen Auges entscheidend ist. CRISPR-Cas9-generierte somatische Mutationen wurden durch Screening auf Pigmentverlust in den Augen im Pupillenstadium von injizierten Personen bewertet. Somatische Mutationen lagen im Allgemeinen als Mosaik-Phänotypen vor, bei denen einige, aber nicht alle Zellen den mutierten Phänotyp aufweisen.
DieKeimbahnmutationsraten wurden durch Kreuzung von Mosaik-G-Null-Individuen und Scoring pro vollständig weißäugigem Nachkommen bestimmt. Diese Experimente führten zu einer Überlebensrate von 64 bis 82 %, einer somatischen Mutageneserate von 37 bis 57 % und einer Mutageneserate von mehr als 61 %. Durch das Multiplexing von sgRNAs, die auf mehrere Loci im selben Gen abzielen, stiegen die somatischen und Keimbahn-Mutageneseseraten auf bis zu 86 %. Darüber hinaus wurden über viele Generationen hinweg lebensfähige homozygote Stämme der weißen Mutanten erfolgreich im Labor gehalten.
Um die Überlebens- und Mutageneseraten zu optimieren, sollten alle Materialien, einschließlich Halogenkohlenwasserstofföl, Injektionsflüssigkeit und Nadeln, vor dem Versuch von Mikroinjektionen ordnungsgemäß vorbereitet werden. Dies ermöglicht einen schlankeren und fokussierteren Mikroinjektionsprozess.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionsmethoden für Culex quinquefasciatus-Embryonen, die für die CRISPR/Cas9-Genbearbeitung optimiert sind. Es ermöglicht die effiziente Erzeugung vererbbarer Keimbahnmutationen für genetische Forschung und Vektorbekämpfungstechnologien.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Gentechnik
- Vektorbiologie
- CRISPR/Cas9-Technologie
Hintergrund
- Culex quinquefasciatus ist ein wenig erforschter Krankheitsüberträger.
- Mikroinjektionstechniken sind entscheidend für die Entwicklung genetischer Kontrollwerkzeuge.
- Bestehende Protokolle für andere Insektenarten sind gut etabliert.
- Diese Methode berücksichtigt die einzigartigen biologischen Merkmale von Culex-Arten.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Mikroinjektionsprotokolls für Culex quinquefasciatus.
- Erleichterung von Genfunktionsstudien und genetischen Kontrolltechnologien.
- Optimierung der Überlebens- und Mutagenesequoten in injizierten Embryonen.
Verwendete Methoden
- Eiersammlung und Techniken zur Trennung der Eiräume.
- Zubereitung von Halocarbon-Öl und Injektionsgemisch.
- Mikroinjektion von Embryonen mittels Mikromanipulator.
- Screening auf mutante Phänotypen nach der Injektion.
Hauptergebnisse
- Erreichte Überlebensrate der Embryonen von 64–82 %.
- Die Raten der somatischen Mutagenese lagen zwischen 37 und 57 %.
- Die Raten der Keimbahn-Mutagenese überstiegen 61 %.
- Die Multiplexierung von sgRNAs erhöhte die Mutageneseraten auf 86 %.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll erzeugt erfolgreich somatische und Keimbahnmutationen.
- Lebensfähige homozygote Stämme von Mutanten wurden im Labor gehalten.
- Eine sachgemäße Vorbereitung der Materialien verbessert den Mikroinjektionsprozess.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die effiziente Embryoinjektion ermöglicht die gezielte Mutagenese in Culex quinquefasciatus, einem wichtigen Vektor für Krankheiten wie das West-Nil-Virus und die lymphatische Filariose. Diese Fähigkeit unterstützt die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase, indem vererbbare Mutationen für funktionelle Genstudien erzeugt werden. Das Protokoll berücksichtigt artenspezifische Barrieren und verbessert so die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Vektorbekämpfungszielen und der Entwicklung präklinischer Modelle.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch gezielte Gen-Knockouts in einem für die Krankheitsübertragung relevanten Insektenvektor.
- Operationaler Wert: Bietet ein reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung von Keimbahnmutationen für die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, die an der Pathogenübertragung beteiligt sind.
- Predictiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem genetische Störungen mit phänotypischen Ergebnissen verknüpft werden, die für die Vektorfähigkeit entscheidend sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare Mutagenese-Nachweise (somatische und Keimbahnraten) zur Beurteilung der Editier-Effizienz verschiedener guide-RNA-Designs.
- Operativer Wert: Standardisiert das Handling von Embryonen und Injektionsbedingungen und verbessert so die Reproduzierbarkeit des Assays über verschiedene experimentelle Ansätze hinweg.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die multiplexe sgRNA-Abgabe, um Mutagenese-Raten zu erhöhen und Hochdurchsatz-Screenings von Zielstrukturen zu unterstützen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt vererbbare Weißaugen-Mutanten, um stabile genetische Linien für langfristige phänotypische und Vererbungsstudien zu etablieren.
- Operativer Wert: Erreicht Überlebensraten von 64–82 % bei Embryonen und stellt somit eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Mutanten für nachgeschaltete phänotypische Screening-Verfahren sicher.
- Translationaler Zusammenhang: Erhält lebensfähige homozygote Mutantenstämme über mehrere Generationen hinweg und ermöglicht so die präklinische Bewertung genetischer Kontrollstrategien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Zielhypothesenbildung bis zur Identifizierung von Leitstrukturen ein, indem sie die funktionelle Genomik in einer bisher wenig erforschten Vektorspezies ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung mittels CRISPR/Cas9-vermittelter Mutagenese, um die Genfunktion in Wirt-Pathogen-Interaktionen zu klären.
- Screening: Ermöglicht quantitative Mutagenese-Raten (37–57 % somatisch, >61 % Keimbahn), um die Wirksamkeit von guide-RNAs zu vergleichen und die Bedingungen für die Genbearbeitung zu optimieren.
- Analytik: Ermöglicht die Bewertung von Mutanten-Phänotypen durch stereoskopisches Screening und liefert quantifizierbare Ergebnisse zur Bestätigung von Hits.
- Translationale Forschung: Gewährleistet einen nahtlosen Übergang von der Genentdeckung zur Entwicklung präklinischer Modelle durch die Erzeugung stabiler Mutantenlinien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen standardisierten Mikroinjektionsablauf, der auf verschiedene Culex-Arten übertragbar ist und die wiederholte Entwicklung von Protokollen vermeidet.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten, indem eine direkte Verknüpfung von Genotyp und Phänotyp in einem Modell für vektorübertragene Krankheiten ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Steigert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Schritte zur Ei-Ausrichtung, Halogenkohlenwasserstoff-Überlagerung und Nadelvorbereitung.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch von Projekten, indem funktionelle Validierung von Zielstrukturen bereitgestellt wird, die für das Überleben des Vektors oder die Pathogenübertragung unerlässlich sind.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf vererblichen Mutationsraten und phänotypischer Schwere.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Embryonen, in Mikromanipulation sowie in fluoreszenz- oder stereoskopischer Analyse.
- Ist abhängig von der Herstellung von Nadeln, Mikroinjektoren und Halogenkohlenwasserstofföl für die Embryonalviabilität.
- Erfordert eine standardisierte, interdisziplinäre Methodik bei der Eiersammlung und Trennung der Eierraften.
- Kann bei verschiedenen Culex-Arten Anpassungen des Injektionsvolumens und der Nadelform erfordern.
- Praktische Einschränkungen umfassen die Empfindlichkeit der Embryonen und die Notwendigkeit einer unmittelbaren Wiederherstellung nach der Injektion, um die Überlebensraten aufrechtzuerhalten.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Alignment of C. quinquefasciatus Pre-blastoderm Stage Embryos
1:46
Embryo Microinjection
3:32
Embryo Recovery and Hatching
4:08
Results: Survival and Mutation Rates of Embryos Injected with Single and Multiplexed gRNAs Targeting White
5:25
Conclusion
