Skelett-Phänotyp-Analyse eines bedingten Stat3-Löschmausmodells
3. Juli 2020
Dieses Protokoll beschreibt eine kanonische Methode, um die kritischen Gene zu verstehen, die die Osteoklastaktivität in vivo steuern. Diese Methode verwendet ein transgenes Mausmodell und einige kanonische Techniken, um Skelett-Phänotyp zu analysieren.
Gentechnisch veränderte Mausmodelle sind leistungsfähige Werkzeuge, um die Mechanismen menschlicher Krankheiten in vivo zu untersuchen. Die Analyse des Skelettphänotyps von Mäusen ist die Grundlage der Skelettforschung. Dieses Partikel beschreibt einige typische Techniken zur Analyse des Skelettphänotyps, die für diejenigen interessant sein können, die neu in der Skelettgewebeforschung sind.
Wenn Sie dieses Teilchen versuchen, denken Sie daran, dass Tierversuche Zeit brauchen, also sammeln Sie bei jedem Experiment so viele qualitativ hochwertige Proben wie möglich, auch wenn Sie sie kurzfristig nicht benötigen. Beginnen Sie damit, eine eingeschläferte Maus in Rückenlage zu bringen und die beidseitigen Hüftgelenke vorsichtig mit der Hand auszurenken. Schneiden Sie mit einer Augenschere die Haut vertikal von der distalen Tibia ab und entfernen Sie dann die gesamte Haut von der hinteren Extremität.
Schneiden Sie das Gelenkband des rechten Hüftgelenks und des Kniegelenks mit einer Schere ab, um die hintere Extremität zu trennen. Schneiden Sie dann den Knochen an beiden Enden ab, um den Knochen vollständig in 4%PFA einzutauchen. Schneide den Trochanter und den Übergang der Fibula ab.
Tauchen Sie die hintere Gliedmaße in 4 % PFA und behalten Sie die rechte hintere Gliedmaße für die Paraffinschnitte bei. Schneiden Sie die Gelenkbänder der linken Hüfte und des Kniegelenks mit einer Schere ab und entfernen Sie vorsichtig das Weichgewebe. Trennen Sie das Schienbein und den Oberschenkelknochen und tauchen Sie sie separat in 75%iges Ethanol.
Bewahren Sie die Oberschenkelknochen für die Mikro-CT-Untersuchung und die Tibien für die doppelte Markierung von Calcein und Alizarin rot auf. Um die Paraffinabschnitte vorzubereiten, waschen Sie die fixierte rechte Hintergliedmaße dreimal vorsichtig mit PBS für 10 Minuten pro Waschgang. Entkalken Sie es dann drei bis vier Wochen lang in 15% EDTA mit einem Ultraschall-Entkalker, bis die Knochen gebogen werden können, und ersetzen Sie die Entkalkungsflüssigkeit jeden zweiten Tag.
Waschen Sie die Proben nach der Entkalkung dreimal mit PBS und tauchen Sie sie über Nacht in 75%Ethanol bei vier Grad Celsius. Tauchen Sie die Proben am zweiten Tag nacheinander jeweils eine Stunde lang in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und Xylol. Tauchen Sie die Proben 30 Minuten lang zur Hälfte in Xylol und zur Hälfte in Paraffin, dann über Nacht in Paraffin bei 65 Grad Celsius.
Um die Probe einzubetten, tauchen Sie sie in Paraffin und platzieren Sie den Oberschenkelknochen und das Schienbein in einem 90-Grad-Winkel. Wenn das Paraffin vollständig abgekühlt ist, nehmen Sie die Proben aus dem Einbettbehälter. Nummerieren Sie sie und lagern Sie sie über Nacht bei minus 20 Grad Celsius.
Die Paraffinabschnitte 30 Minuten bei 65 Grad Celsius backen und dann entwachsen, indem man sie 10 Minuten lang in Xylol taucht. Tauchen Sie die Abschnitte jedes Mal dreimal mit frischem Xylol. Rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie nacheinander fünf Minuten lang in 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 70 % Ethanol und destilliertes Wasser tauchen.
Bereiten Sie die Färbelösung mit dem Färbeset TRAP vor und erwärmen Sie sie auf 37 Grad Celsius. Geben Sie 50 bis 100 Mikroliter Färbelösung in jede Sektion und inkubieren Sie sie 20 bis 30 Minuten lang in einer 37 Grad Celsius feuchten Kammer. Kontrollieren Sie alle fünf Minuten den Färbestatus der Osteoklasten unter einem Lichtmikroskop, bis rote mehrkernige Osteoklasten zu sehen sind.
Beenden Sie dann die Reaktion mit Wasser. Färben Sie die Abschnitte 30 Sekunden lang in Hämatoxylinlösung und erzeugen Sie eine stabile blaue Farbe, indem Sie sie eine Minute lang in 1%ige Ammoniaklösung tauchen. Spülen Sie sie dann in langsam fließendem Leitungswasser ab.
Montieren Sie die Abschnitte mit Deckgläsern mit neutralem Balsam und trocknen Sie sie über Nacht. Erfassen Sie drei bis fünf Sichtfelder mit einem Mikroskop und analysieren Sie den trabekulären Umfang mit Bild J.Verwenden Sie das Werkzeug für gerade Linien, um die Länge der Maßstabsleiste als L1 zu messen. Verwenden Sie dann das Werkzeug für segmentierte Linien, um die Länge des Trabekelumfangs als L2 zu messen. Berechnen Sie die physikalische Länge und zählen Sie die Anzahl der TRAP-positiven Zellen mit mehr als drei Kernen. Waschen Sie die Tibien nach der Fixierung dreimal vorsichtig mit PBS und tauchen Sie die Proben nacheinander jeweils fünf Minuten lang in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und Xylol.
Tauchen Sie die Proben 12 Stunden lang in Aceton und zwei Stunden lang zur Hälfte in Aceton und zur Hälfte in Harz und über Nacht in einem Trockenofen in reines Harz. Geben Sie reines Harz in einen geeigneten Kieselgel-Einbetttank und legen Sie die Proben in den Tank, um Blasen zu vermeiden. Polymerisieren Sie das Harz in einem Trockenschrank bei 60 Grad Celsius für 48 Stunden.
Schneiden Sie die Proben kontinuierlich mit einem rotierenden Mikrotom in fünf Mikrometer dicke Abschnitte und lagern Sie den Rest der Proben mit Trockenmittel bei Raumtemperatur. Kleben Sie die Abschnitte mit einer Pinzette in einen Tropfen 75%Ethanol und befestigen Sie sie mit Deckgläsern mit neutralem Balsam. Erfassen Sie die rote und grüne Fluoreszenzmarkierung mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Osteoklasten-spezifische Stat3-Deletionsmäuse wurden generiert, um den Einfluss der Stat3-Deletion auf die Osteoklastendifferenzierung zu untersuchen. Die Femurrekonstruktion und die quantitative Analyse mittels Mikro-CT zeigten, dass die Knochenmasse der Stat3 Ctsk-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen erhöht war. Die Histomorphologie der Femora von Wildtyp- und Stat3 Ctsk-Mäusen wurde mittels H- und E-Färbung untersucht.
Die osteoklastogene Aktivität wurde mittels TRAP-Färbung nachgewiesen. Osteoklasten sind große TRAP-positive Zellen mit mehreren Zellkernen. Die Anzahl der TRAP-positiven Osteoklasten war bei Stat3-Ctsk-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen geringer, was darauf hindeutet, dass ein Stat3-Mangel die Osteoklastenbildung beeinträchtigte.
Die Osteogenese wurde mit Calcein und Alizarinrot Doppelmarkierung gemessen. Der Bereich zwischen dem Calcein und der Alizarin-Rotfluoreszenz stellt den neu gebildeten Knochen dar. Das deletierte Stat3 in Osteoklasten hatte keinen Einfluss auf den Knochenanabolismus.
Sagittale Paraffinschnitte, bei denen der Knorpel später symmetrisch war und die zeigten, dass hier eine klare M-förmige Linie verwendet wurde. Für die Studien werden wir weitere Merkmale des Skelettsystems einbeziehen, wie z. B. mechanische Eigenschaften.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie untersucht die Rolle wichtiger Gene bei der Osteoclastenaktivität unter Verwendung genetisch veränderter Mausmodelle. Das Protokoll beschreibt Techniken zur Analyse von Skelettphänotypen und betont die Bedeutung hochwertiger biologischer Proben.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Knochenbiologie
- Osteoklastendifferenzierung
- Genetische Regulation der Knochenremodellierung
Hintergrund
- Bedeutung von Osteoklasten für die Knochengesundheit
- Verwendung transgener Mäuse zur Modellierung menschlicher Krankheiten
- Notwendigkeit strenger experimenteller Protokolle
Verwendete Methoden
- Skelettanalyse unter Verwendung einer Vielzahl histologischer Techniken
- Transgene Mausmodelle (Stat3 Ctsk Mäuse)
- TRAP-Färbung, Mikro-CT-Scannen und Doppelfärbung zur Messung der Knochenbildung
Hauptergebnisse
- Der Mangel an Stat3 verringerte die Osteoklastenbildung
- Erhöhte Knochenmasse bei Stat3 Ctsk-Mäusen im Vergleich zum Wildtyp
- Die Studie bestätigt die Rolle des Gens bei der Differenzierung von Osteoklasten und legt einen Mechanismus für die Regulation der Knochenmasse nahe
Schlussfolgerungen
- Diese Studie zeigt, wie die Genregulation das Verhalten von Osteoklasten und die allgemeine Knochengesundheit beeinflussen kann.
- Die Ergebnisse sind von Bedeutung für therapeutische Ansätze bei Erkrankungen, die mit Knochenverlust verbunden sind.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der genetischen Funktion spezifisch für Osteoklasten ermöglicht eine mechanistische Risikominderung bei der Entwicklung knochenwirksamer Therapeutika. Bedingte Knockout-Modelle liefern eine vorhersagbare Sicherheit für die Zielvalidierung, indem sie den zellulären Beitrag zum Knochenumbau isolieren. Dieser Ansatz unterstützt die präklinische Bewertung der Modulation anaboler versus kataboler Signalwege in der Arzneimittelforschung für Osteoporose.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft die therapeutische Hypothese zur Rolle von STAT3 bei der Osteoklastendifferenzierung und Knochenresorption.
- Operativer Wert: Ermöglicht die funktionelle Target-Validierung durch zellspezifische genetische Ablation in vivo.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Entlastung von Risiken, indem die Verbindung zwischen STAT3-Verlust und verminderter Osteoklastenbildung sowie erhöhter Knochenmasse hergestellt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme (Knochengewebe) für die Standardisierung und Reproduzierbarkeit nachgeschalteter Assays vor.
- Operativer Wert: Erzeugt quantitative Ergebnisse (TRAP+ Zellanzahl, Knochenfläche, Mikro-CT-Metriken) zur zuverlässigen Substanzbewertung.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Bereitschaft für Screening-Verfahren durch standardisierte Histologie- und Bildgebungsabläufe.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Demonstriert die systemische Kohärenz von der genetischen Zielmodulation bis zum skelettalen Phänotyp unter krankheitsrelevanten Bedingungen.
- Operativer Wert: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung durch gleichzeitige Messung von Resorptions- (TRAP) und Bildungsendpunkten (Calcein/Alizarin).
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert mechanistische Erkenntnisse zur Regulation der Knochenmasse über osteoklastenspezifische Signalwege.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode unterstützt die Entdeckungsbiologie durch die Hypothesenprüfung der osteoklasteninternen Genfunktion und die Aufklärung von Signalwegen im Knochenstoffwechsel.
- Entdeckungsbiologie: Erläutert, wie die bedingte Deletion die Hypothesenprüfung von STAT3 in Osteoklasten und die biologische Entrisikobewertung von Resorptionszielen unterstützt.
- Screening: Beschreibt die Bereitstellung von Assays mittels standardisierter Gewebepräparation und quantitativer histomorphometrischer Analyse für die Wirkstoffscreening.
- Analytik: Betont Mikro-CT, TRAP-Färbung und Doppelmarkierung als quantitative Messgrößen, die einen vergleichenden Abgleich des Knochenphänotyps über verschiedene Bedingungen hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet genetische Modifikation mit präklinischer Kontinuität durch integrierte Analyse von Resorption und Bildung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Validierung osteoklastenspezifischer Zielstrukturen in Modellen von Knochenerkrankungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Unschärfen in der Osteoklastregulation.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Skelett-Phänotypisierungsabläufen.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und reduziertes biologisches Risiko in der späten Phase bei Knochen-Therapeutika.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Voranbringungsentscheidungen basierend auf der Validierung des On-Target-Mechanismus.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige Fachkenntnisse in der Mausgenetik, Knochenhistologie und Mikro-CT-Analyse.
- Zu den erforderlichen Geräten gehören Mikrotom, Fluoreszenz- und Lichtmikroskope, Mikro-CT-Scanner sowie Entkalkungsausrüstung.
- Die Standardisierung über Teamgrenzen hinweg erfordert harmonisierte Färbeprotokolle und bildgebende Analyseverfahren zwischen Histologie- und In-vivo-Teams.
- Bei der Übertragung auf verschiedene Modellsysteme ist darauf zu achten, die Spezifität des Cre-Systems sowie kompensatorische Signalwege in anderen Osteoklastmodellen zu überprüfen.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen der zeitaufwändige Entkalkungs- und Schnittprozess sowie mögliche entwicklungsbedingte Kompensationseffekte in konstitutiven Modellen.
