Ein Ansatz zur Untersuchung formabhängiger Transkriptomik auf einer Ebene einer einzelzelligen Ebene
2. November 2020
Dieses Papier stellt Methoden für den Anbau von Herzmyozyten mit verschiedenen Formen, die verschiedene Pathologien darstellen, und das Sortieren dieser anhaftenden Herzmyozyten basierend auf ihrer Morphologie auf einer einzelnen Zellebene. Die vorgeschlagene Plattform bietet einen neuartigen Ansatz für hohe Durchsatz- und Arzneimittelscreenings für verschiedene Arten von Herzinsuffizienz.
Wir schlagen eine neuartige Plattform zur Untersuchung der Auswirkungen der Zellform auf die Genexpression vor, indem Methoden zum Anbau und Sortieren von Aufhaltungen mit verschiedenen Morphologien auf Einzelzellebene verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Untersuchung der Zellform in vitro mit hohem Durchsatz erleichtert, da der Vergleich von Zellen mit verschiedenen Formen in vivo technisch anspruchsvoll ist. Um eine gemusterte Kardiomyozytenkultur einzurichten, übertragen Sie eine Kardiomyozytensuspension im Seitenverhältnis von Interesse auf eine 15-Milliliter-Röhre zum Zählen und verdünnen Sie die Zellen auf ein mal 10 bis zu den fünf Zellen pro Milliliter geeigneter Beschichtungsmediumkonzentration.
Fügen Sie zwei Milliliter Zellen auf einen fibronectin beschichteten mikrogemusterten Chip in zwei Milliliter warmes Beschichtungsmedium in einer 35 Milliliter Grenier Petrischale und legen Sie die Schale in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator für 18 Stunden. Überprüfen Sie am nächsten Tag den Chip mit lichtmikroskopischer Mikroskopie, um zu bestätigen, dass die meisten Zellen angebracht sind. Entfernen Sie das Medium aus der Schale, um Schmutz und abgestorbene Zellen zu entfernen, und beginnend von der Mitte und in Richtung der Seiten in einer tropfenweise Weise, sanft HINZUFÜGEN PBS zu den Zellen.
Nach der dritten Wäsche das PBS durch ein Vier-Milliliter-Wartungsmedium ersetzen und die Zellen in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen. Nach 72 Stunden die Spanoberfläche zwei Mal vorsichtig mit zwei Millilitern warmer Dulbecco-PBS pro Waschgang spülen und den gewaschenen Chip sofort auf eine neue sterile 35 Milliliter Grenier Petri Schale übertragen. Fügen Sie schnell 1,5 Mikroliter lebendiges Dicycle Grün verdünnt 1000-fach in DPBS auf den Chip.
Befestigen Sie eine Kammer über dem Chip und legen Sie die Schale auf den Tellerhalter der Zelle Picker-Bühne. Setzen Sie die Magnetkappe ein und suchen Sie das Fadenkreuz im Live-Ansichtsfenster. Konzentrieren Sie sich auf das Fadenkreuz und wählen Sie im Scan- und Sortierfenster die Kalibrierung für die automatisierte Injektion und Kalibrierung aus.
Ersetzen Sie den Tellerüberstand durch 1,5 Milliliter eines 1:1-Triple-E in DPBS-Lösung, um die Zellen aus dem Fibronectin zu lösen und die Scan-Registerkarte zu öffnen. Um den gesamten Chip zu scannen, konzentrieren Sie sich auf die obere linke Ecke des Chips im Sichtfeld und klicken Sie auf aktuelle Mikroskopposition. Als nächstes konzentrieren Sie sich auf die untere rechte Ecke des Chips und klicken Sie auf aktuelle Mikroskopposition.
Klicken Sie im Popup-Fenster auf Schärfste auf festlegen, und klicken Sie auf Rechts oben und gehen Sie zu den linken oberen Schaltflächen. Klicken Sie dann auf Fertig stellen, um mit dem Scannen zu beginnen. Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, öffnen Sie die Registerkarte Analysieren, und klicken Sie auf Karte anzeigen, um die einzelnen Zellen auszuwählen, die die Studienkriterien bestehen.
Zentrieren Sie die Glasmikrokapillare in der Mitte des Mikroskops Live-Ansicht und öffnen Sie die Pumpe Lasche. Um ein Vakuum zu erzeugen, ziehen Sie den Kolben von einer 50 Milliliter Spritze Nummer eins vier Milliliter ein und öffnen Sie die Sortierlasche. Um die Kommissionierung einer einzelnen Zelle zu ermöglichen, stellen Sie das Ventil zwei für 120 Millisekunden und das Ventil 1 für 20 Millisekunden nach einem Zeitraffer von 200 Millisekunden ein.
Damit die entnommene Zelle erfolgreich in ihren PCR-Rohr mit Lysepuffer geliefert werden kann, stellen Sie das Ventil 1 für 20 Millisekunden und das Ventil zwei für 10 Millisekunden nach einem Zeitraffer von 10 Millisekunden ein. Wenn die Ventileinstellungen angepasst wurden, klicken Sie auf Pfad berechnen. Die Software berechnet den schnellsten Pfad von Zelle zu Zelle für die Aufnahme und Injektion der ausgewählten Zellen im gesamten Chip.
Konzentrieren Sie das Mikroskop dann auf ein Muster auf der Spanoberfläche. Verwenden Sie den Joystick, um die Mikrokapillare vorsichtig nach unten zu bewegen, so dass das schärfste Bild der Spitze der Mikrokapillare erhalten werden kann, ohne die Spanoberfläche zu berühren und auf Set zu klicken. Es öffnet sich ein neues Fenster, das den Mikrokapillarquerschnitt zeigt.
Um die Software den Spitzenversatz der Kapillare in den X-, Y- und Z-Koordinaten aufzeichnen zu lassen, klicken Sie auf die genaue Mitte der Kapillare. Klicken Sie dann auf Sortieren starten, um die Sortierung zu starten. Bei dieser repräsentativen Analyse der vorverstärkten cDNA aus einer entnommenen Einzelzelle wurde ein klares Band im Gel wie densitometry-Plot beobachtet, das dem Peak bei 1, 852 Basenpaaren im Elektropherogramm entspricht.
Die durchschnittliche Größe der Fragmente betrug 1, 588 Basenpaare mit einer kleinen Anzahl von Fragmenten, die kürzer als 300 Basenpaare waren, was auf die Generierung einer guten cDNA-Bibliothek hinweist. Immunfluoreszierende Färbung und Analyse können auch durchgeführt werden, um die Sarkome-Struktur innerhalb der gemusterten Kardiomyozyten zu bewerten. Diese Plattform ebnet den Weg für Hochdurchsatzstudien und Arzneimittelscreenings für verschiedene Arten von Herzinsuffizienz.
Übersicht
Diese Studie stellt eine neuartige Plattform zum Kultivieren und Sortieren von Herzmuskulaturzellen basierend auf ihrer Morphologie auf Einzelzell-Ebene vor. Diese Methode ermöglicht ein Hochdurchsatz-Screening von Wirkstoffen für verschiedene Arten von Herzinsuffizienz.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kardiomyozyten-Kultur
- Analyse der Zellmorphologie
- Methoden zur Wirkstoffscreening
Hintergrund
- Kardiomyozyten weisen vielfältige Formen auf, die mit verschiedenen Pathologien korrelieren.
- Die Untersuchung der Auswirkungen der Zellform auf die Genexpression ist in vivo schwierig.
- Hochdurchsatztechniken sind entscheidend für eine effiziente Arzneimittelscreening.
- Aktuelle Methoden sind ineffizient bei der Sortierung und Analyse einzelner Zellen basierend auf der Morphologie.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Plattform zur Untersuchung des Einflusses der Zellform auf die Genexpression.
- Vereinfachung der Sortierung kardialer Myozyten basierend auf ihrer Morphologie.
- Verbesserung der Wirkstoffscreening-Verfahren für die Behandlung von Herzinsuffizienz.
Verwendete Methoden
- Herstellung und Verdünnung der Kardiomyozytensuspension.
- Verwendung von fibronectinbeschichteten mikrostrukturierten Chips für die Zellkultur.
- Light Microscopy zur Bestätigung der Zelladhäsion.
- Automatisiertes Scannen und Sortieren einzelner Zellen mittels eines Mikrokappillarsystems.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Anheftung und Aufrechterhaltung von strukturierten Kardiomyozyten.
- Erzeugung einer qualitativ hochwertigen cDNA-Bibliothek aus sortierten Einzelzellen.
- Immunfluoreszenz-Färbung zeigte Sarkomer-Strukturen.
- Die Plattform ermöglicht Hochdurchsatz-Studien und Wirkstoffscreening.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Plattform bietet einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung von Herzmuskulaturzellen.
- Sie ermöglicht eine effiziente Sortierung und Analyse von Zellen basierend auf ihrer Morphologie.
- Diese Methode kann die Forschung zu Therapien der Herzinsuffizienz erheblich voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Plattform ermöglicht die systematische Untersuchung, wie die Morphologie kardialer Myozyten die Genexpression beeinflusst, und schließt damit eine entscheidende Wissenslücke im Verständnis der formabhängigen transkriptomischen Regulation bei Herzinsuffizienz. Durch die Verknüpfung definierter geometrischer Morphotypen mit pathologischen Phänotypen wie hypertropher und dilatativer Kardiomyopathie schafft sie eine mechanistische Brücke zwischen zellulärer Struktur und krankheitsrelevanten Signalwegen. Die Methode unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien und das phänotypische Screening, indem sie reproduzierbare, nach Morphologie stratifizierte Einzelzell-Transkriptomdaten liefert, um therapeutische Hypothesen zu entrisiken.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem spezifische Seitenverhältnisse von Kardiomyozyten mit Genexpressionsprofilen in Verbindung gebracht werden, die mit pathologischem Remodeling assoziiert sind.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch standardisierte, morphologisch kontrollierte Einzelzellisolation und transkriptomische Profilierung.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem formabhängige molekulare Signaturen identifiziert werden, die die Wirkstoffwirksamkeit über verschiedene Herzinsuffizienz-Subtypen hinweg vorhersagen könnten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erstellt validierte biologische Systeme mit präzisen Längen:Breite-Seitenverhältnissen für die anschließende Wirkstoff-Screening in Herzinsuffizienz-Modellen.
- Operationeller Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit des Assays mittels mikrostrukturierter Fibronectin-Chips, die einheitliche Zellmorphologien über alle Wiederholungen hinweg sicherstellen.
- Skalierbarkeit: Unterstützt Hochdurchsatz-Screening durch automatisiertes Einzelzell-Picking und Injektion in Puffer zur lysen, um parallele Prozessierung zu ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die entdeckungsphasenbezogene, morphologisch stratifizierte Transkriptomik mit der präklinischen Validierung, indem HCM- und DCM-assoziierte Geometrien modelliert werden.
- Biomarker-Korrelation: Ermöglicht die Identifizierung formabhängiger transkriptomischer Signaturmuster, die als prädiktive Indikatoren für die Behandlungsreaktion dienen könnten.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem aufgezeigt wird, wie die Zellform die Aktivierung von Signalwegen als Reaktion auf pharmakologische Störungen beeinflusst.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess, indem sie eine hypothesengetriebene Analyse der Auswirkungen der Zellform vor der Identifizierung von Leitstrukturen ermöglicht, wobei die Ergebnisse die Auswahl präklinischer Modelle sowie mechanistische Entwicklungsstrategien zur Risikominimierung informieren.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die mechanistische Entrisikobewertung, indem die Variable der Zellform isoliert wird, um deren Rolle in der transkriptionellen Regulierung unter normalen und pathologischen Bedingungen zu klären.
- Screening: Stellt assaysbereite, morphologisch definierte Kardiomyozytenpopulationen bereit, die eine zuverlässige Wirkstoffbewertung in der Arzneimittelentwicklung gegen Herzversagen ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt quantitative, einzelzellbasierte transkriptomische Messungen, die den Vergleich der Genexpression zwischen unterschiedlichen geometrischen Morphotypen erlauben.
- Translationale Forschung: Bietet krankheitsrelevante Systeme, die konzentrische und exzentrische Hypertrophie durch gezielte Seitenverhältnisse modellieren und so die präklinische Durchgängigkeit verbessern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für iterative Screeningkampagnen über mehrere Herzversagenphänotypen und Wirkstoffbibliotheken hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem die Unschärfe, mit der die zelluläre Morphologie Signalwege beeinflusst, verringert wird.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch mikrostrukturierte Kulturen und automatisierte Einzelzell-Handhabung.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem eine frühzeitige Erkennung formabhängiger biologischer Reaktionen ermöglicht wird, die auf eine klinische Übertragbarkeit hindeuten können.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf deren Wirkungen in morphologisch stratifizierten Kardiomyozyten-Modellen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur kardialer Zellen, Mikromustertechniken und Einzelzell-Manipulationssystemen.
- Setzt den Zugang zu fibronectinbeschichteten mikromustergestanzten Chips, Fluoreszenzmikroskopie und automatisierten, mikrokapillarbasierten Zellselektoren voraus.
- Erfordert eine standardisierte Definition des Seitenverhältnisses und der transkriptomischen Analyse-Pipelines über Teamgrenzen hinweg, um eine konsistente Interpretation zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Plattform auf andere Zelltypen oder Krankheitsmodelle über kardiale Myozyten hinaus ausgeweitet wird.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die Notwendigkeit, Zelldichte und Inkubationszeiten zu optimieren, um eine gleichmäßige Anheftung über alle Mikromuster hinweg sicherzustellen.
