Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Dieses Ratten-Hepatozyten-Isolationsprotokoll basiert auf der Leberresektion vor dem Verdauungsansatz. Das Protokoll führt ein kompaktes und tragbares integriertes Perfusionssystem zur Zellisolierung ein. Diese Technik beinhaltet eine Kollagenase-Rezirkulation, die das Volumen der Kollagenase-Nutzung reduziert und mehr Flexibilität bei der Verlängerung der Verdauungszeit bietet, während gleichzeitig eine hohe Schwerkraftausbeute und eine hepatozytenspezifische Funktion gewährleistet werden.

Legen Sie die Ratte in die Kapuze. Nachdem Sie die Bauchmuskulatur geschnitten haben, drücken Sie den Darm mit der Rückseite der gekrümmten Pinzette nach rechts. Brechen Sie die Membran unter dem Gallengang mit der Spitze der gekrümmten Pinzette auf, um die Naht um die Pfortader und den Gallengang zu schleifen.

Verwenden Sie eine chirurgische Seidennaht, um eine sehr lockere Ligatur um die Pfortader in der Nähe der Leber zu machen, kurz bevor sich die Vene links und rechts in verschiedene Leberlappen verzweigt. Etwa zwei bis drei Zentimeter vor der ersten Ligatur, kurz bevor sich die Magenvene von der Pfortader abzweigt, erzeugen ein Loch durch das Gewebe unter der Pfortader mit den Spitzen von zwei Paaren gekrümmter Pinzetten. Dehnen Sie dann das Loch, um die Pfortader während der Kanülierung zu stützen.

Verhindern Sie Druckaufbau in der Leber, indem Sie die Pumpendrehzahl auf vier U / min für eine Durchflussrate von etwa drei Millilitern pro Minute reduzieren. Und stellen Sie sicher, dass der Abfluss des kalziumfreien Puffers aus dem intravenösen Katheter auf einen langsamen Tropf reduziert wird. Während Sie die Pfortader vorsichtig mit einer Pinzette stützen, halten Sie den intravenösen Katheter mit der Fase der Nadel nach oben.

Und führen Sie die Nadel in einem Winkel von 10 bis 20 Grad in die Pfortader ein. Fahren Sie dann langsam voran, bis sich die gesamte Fase in der Vene befindet. Das korrekte Einsetzen sollte zum Blanchieren der Leberfarbe führen.

Bewegen Sie die Kanüle über die Nadel und ziehen Sie die Nadel hinter der Kanüle zurück, indem Sie den Flügel mit dem Zeigefinger zurückziehen, während Sie den Katheter mit Daumen und Mittelfinger halten. Befestigen Sie die Pfortader mit einem Venenclip am Katheter und Clip unterhalb der Pfortadere, um eine Durchdringungsunterbrechung des Flusses zu vermeiden. Als nächstes schneiden Sie die infrahepatische untere Hohlvene ab, um den Druckaufbau in der Leber zu verhindern, und achten Sie auf Blutspritzimpulse, um den richtigen Schnitt sicherzustellen.

Erhöhen Sie die Pumpendrehzahl auf 38 U / min für eine Durchflussrate von ca. 33 Millilitern pro Minute. Und spülen Sie die Leber dreimal, indem Sie die infrahepatische untere Hohlvene für zwei bis drei Sekunden mit einer Pinzette schließen und sie dann wieder öffnen. Um alle Leberlappen zu durchbluten, passen Sie die Position der Kanülenspitze an und stellen Sie sicher, dass sie platziert wird, bevor sich die Pfortader in verschiedene Leberlappen verzweigt.

Ziehen Sie dann die lose Ligatur um die Pfortader, leicht stromaufwärts des Verzweigungspunkts, fest und sichern Sie die Position der Kanüle in der Pfortader, um einen Rückfluss des Puffers zu verhindern, indem Sie drei Knoten an der Stelle machen, an der die harte Nadel die Kanüle stützt, zwischen der Fase und dem Seitenloch. Nach der Leberresektion lassen Sie die Leber für 12 Minuten mit dem kalziumfreien Puffer durchbluten. Ziehen Sie dann die Rollenklemme des kalziumfreien Puffers fest und lösen Sie die Rollenklemme des Kollagenasepuffers, um den Perfusionspuffer zu wechseln.

Nachdem der Kollagenasepuffer die Leber erreicht hat, spülen Sie die Leber dreimal aus, indem Sie die suprahepatische untere Hohlvene für zwei bis drei Sekunden schließen und wieder öffnen. Bewegen Sie die Leber vorsichtig auf die Stufe oben auf dem Becherglas, um den Kollagenasepuffer zu rezirkulieren, indem Sie das Zwerchfell mit einer Pinzette halten, während Sie den Katheter stützen, und achten Sie darauf, den Katheter nicht zu ziehen, um ein versehentliches Ablösen zu verhindern. Verdauen Sie die Leber für 12 Minuten und stoppen Sie die Perfusion, wenn die Leber ihre glatte braune Textur verliert und matschig wird.

Verlängern Sie bei Bedarf die Verdauungszeit. Nach der Verdauung der Leber schneiden Sie die Pfortader vorsichtig die Kanüle ab. Und dann übertragen Sie die Leber in kaltes DMEM, um die Hepatozyten zu isolieren.

Klopfen Sie vorsichtig mit der Rückseite der gekrümmten Pinzette auf die Leber, um die Glitzerkapsel zu brechen und abzuziehen. Und geben Sie die Leberzellen frei, indem Sie die Leber in DMEM sanft schwanken, bis die Zellen in den Medien vollständig dissoziiert sind. Die Lebensfähigkeit von Hepatozyten lag zwischen 88 und 94,8%, wie durch Trip- und Blauzählung bestimmt.

Die Ausbeute an Hepatozyten von Ratten mit einem Gewicht von 200 bis 300 Gramm betrug bis zu fünfmal 10 bis achte Zellen pro Isolierung. Die repräsentativen Bilder zeigen eine ungereinigte Leberzellsuspension und eine gereinigte Hepatozytensuspension. Die Reinheit der isolierten Hepatozyten betrug etwa 96,8%, was durch Zählen von Albumin-positiven fluoreszierenden gefärbten Zellen im Verhältnis zur Gesamtzahl der Zellkerne quantifiziert wurde.

In den repräsentativen Bildern, die in falscher Farbe gezeigt werden, steht Grün für das Albumin und Blau für die Zellkerne mit Albumin. Zellkerne ohne Albumin sind rot hervorgehoben. Die Hepatozyten in der Sandwichkultur bildeten ausgeprägte Gallenkanäle und hatten einen guten Zellzellkontakt.

Wie aus Albumin-, Harnstoff- und Cytochrom-P450-Assays hervorgeht, wiesen die Hepatozyten eine hohe Harnstoff- und Albuminsekretion auf. Am dritten Tag zeigten die Hepatozyten hohe Enzymaktivitäten für CYP1A2, CYP2B1/2 und CYP3B2. Seien Sie mental vorbereitet, bevor Sie die Nadel in die Pfortader einführen.

Nach dem Einsetzen muss ein Chirurg ohne Puls fortfahren, bis die Pumpendrehzahl nach dem Schneiden des IVC erhöht wurde.