Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Die genetische Forschung hat stark von der Veröffentlichung der Sequenz des menschlichen Genoms profitiert. Pyrosequenzierung ist ein einzigartiges System, das die Analyse genetischer Variation sowie der RNA-Allel-Imbalance, der DNA-Methylierungsstatus und der Genkopienzahl ermöglicht. In diesem Video demonstrieren wir eine grundlegende Pyrosequenzierungsreaktion für die genetische Analyse.

Hallo, ich bin Kristy King aus dem Labor von Dr. Charles Eby und Dr. Brian Gage aus der Abteilung für Innere Medizin an der Washington University School of Medicine. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Pyrosequenzierung. Dieses Verfahren ist nützlich, weil es eine der gründlichsten und dennoch einfachen Methoden zur Analyse von SNPs ist.

Die Pyrosequenzierung basiert auf der Sequenzierung durch Synthese und nutzt die Freisetzung von Pyrophosphat aus, sobald ein Nukleotid in einen offenen dreifachen DNA-Strang eingebaut wird. Sobald eine Platte beladen ist, werden Nukleotide entsprechend einer vom Softwareprogramm vorgegebenen Sequenz eingebaut. Nach ihrer Freisetzung wird das Pyrophosphat in einer Reaktion verwendet, die zur Freisetzung von ATP führt, welches von der Luciferase genutzt wird, um Luciferin in oxidiertes Luciferin umzuwandeln, wodurch Licht emittiert wird. Das emittierte Licht wird von einer CCD-Kamera gesammelt und als Peaks, auch bekannt als Pyros, aufgezeichnet.

Nukleotide, die nicht in den DNA-Strang eingebaut wurden, werden durch AP-Pyrase abgebaut, um Hintergrundrauschen zu vermeiden. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Assay-Design, PCR-Gelelektrophorese zur Qualitätskontrolle und Pyrosequenzierung.

Beginnen wir nun mit der Pyrosequenzierung. Um eine Pyrosequenzierung durchzuführen, muss zunächst ein PCR-Produkt hergestellt werden. Die PCR für die Pyrosequenzierung erfordert mehr Zyklen als die meisten anderen PCR-Ansätze, um sicherzustellen, dass der gesamte Primer verbraucht ist – etwa 50 Zyklen.

Bei der Pyrosequenzierung ist außerdem erforderlich, dass einer der PCR-Primer biotinyliert ist. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass auch ein interner Primer benötigt wird. Eine effiziente Assay-Planung kann mithilfe der über die Pyrosequenzierung bereitgestellten Software durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass keine Kontamination vorliegt.

Und um zu bestätigen, dass das PCR-Produkt vorhanden ist, sollte ein Gel mit einigen Proben sowie einer negativen Kontrolle durchgeführt werden. Um die Pyrosequenzierplatte herzustellen, 12 Mikroliter der Pyrosequenzierprimermischung in die 96-Well-Pyrosequenzierplatte geben. Dazu sind 43,2 Mikroliter des internen Primers zusammen mit 1396,8 Mikrolitern eines Aufschlusspuffers erforderlich. Die Pyrosequenzierplatte mit Haftfolie abdecken.

Wenn der Aufbau länger als 50 Minuten dauert, geben Sie 70 Mikroliter SRO-Speed-Mix pro Bohrung der 96-Loch-PCR-Produktplatte hinzu, der 240 Mikroliter Streptavidin-beschichtete Sero Speeds enthält, 560 Mikroliter Bindungspuffer, der aus Tris-Natriumchlorid, EDTA und Tween 20 hergestellt ist, sowie 3.600 Mikroliter Wasser, und verschließen Sie den Deckel sicher. Stellen Sie die 96-Loch-PCR-Produktplatte mit der Bead-Mischung fünf Minuten lang auf einen Plattenrührer bei Raumtemperatur.

Stellen Sie sicher, dass der Deckel befestigt ist, um eine Kreuzkontamination zwischen den Vertiefungen zu verhindern. Bei diesem Schritt wird eine gründliche Bindung der mit Strep ENC beschichteten Sphärokügelchen an das Biotin-Tag ermöglicht, das sich am PCR-Primer befindet. Richten Sie einen Arbeitsplatz zum Vorbereiten der Platten ein.

Dazu gehören die Reagenzienrinnen, die PCR-Produkt- und Perlenmischungsschale sowie die Pyrosequenzierungsprimer-Schale. Stellen Sie sicher, dass die PCR-Produkt- und Perlenmischungsplatte sowie die Pyrosequenzierungsprimer-Schale korrekt ausgerichtet sind, sodass sich die Negativen in derselben Orientierung befinden. Vor dem Probentransfer schütteln Sie das Vakuumwerkzeug, das zuvor in sauberem Wasser ausgeschaltet wurde, um eventuell anhaftende Perlen oder Rückstände zu lösen.

Entfernen Sie das restliche Wasser, füllen Sie die Wanne erneut auf und schalten Sie das Vakuum ein. Lassen Sie das Vakuumwerkzeug in der Wanne, bis das gesamte Wasser entfernt ist, was etwa 30 Sekunden dauert. Setzen Sie die Filteraufsätze des Vakuumwerkzeugs in die Vertiefungen der PCR-Perlenmischplatte ein und lassen Sie sie so lange dort, bis die gesamte Flüssigkeit aus der Platte entfernt ist.

Ein sanftes Schaukeln kann verwendet werden, um Oberflächenspannung zu vermeiden. Stellen Sie das Vakuum in die 70 % Ethanol enthaltende Wanne, sobald die Flüssigkeit durch die Schläuche zu fließen beginnt. Lassen Sie die Filterspitzen fünf Sekunden lang Ethanol aufsaugen.

Wiederholen Sie dies für die 0,2-molare Natriumhydroxidlösung, die die DNA in einsträngige PCR-DNA denaturiert, und für den Waschpuffer. Um das PCR-Produkt zu reinigen und zu neutralisieren. Trennen Sie den Vakuumschlauch vom Vakuumwerkzeug und setzen Sie das Vakuumwerkzeug in die Pyrosequenzierungsplatte ein, die den Pyrosequenzierungsprimer in einer Pufferlösung enthält.

Falls der Vakuumschlauch noch verbunden ist, wird beim Einsetzen in die Pyrosequenzierplatte die Primer-Mischung durchgesaugt. Die Spitzen führen dazu, dass Sie Ihr PCR-Produkt verlieren. Schütteln oder schwenken Sie die Spitzen des Vakuums vorsichtig in den Vertiefungen der Pyrosequenzierplatte, um Ihr PCR-Produkt zu verteilen.

Entfernen Sie das Vakuumwerkzeug von der Pyrosequenzierungsplatte, sobald das Schütteln oder Schwenken abgeschlossen ist, und schließen Sie das Vakuumwerkzeug erneut an den Schlauch an. Setzen Sie das Werkzeug in sauberes Wasser, um es für die nächste Platte zu reinigen. Stellen Sie die Pyrosequenzierungsplatte zwei Minuten lang auf einen Heizblock bei 80 Grad Celsius. Entfernen Sie die Platte nach zwei Minuten vom Heizblock und stellen Sie sie auf eine gekühlte Oberfläche.

Nach dem Abkühlen kann eine Klebefolie verwendet werden, um die Platte abzudecken, es sei denn, die Platte wird innerhalb von 15 Minuten durchgeführt, um Verdunstung zu verhindern. Nun ist es an der Zeit, mit der Pyrosequenzierung zu beginnen. Der erste Schritt der Pyrosequenzierung besteht darin, die Assay-Details in den Computer einzugeben.

Wählen Sie unter Simplex-Eintrag den neuen Eintrag aus und geben Sie die Assay-Informationen ein, einschließlich eines ID-Namens und der zu analysierenden Sequenz, die von der Assay-Design-Software bereitgestellt wird und die Qualitätskontrolle ermöglicht. Wählen Sie die Dispensierreihenfolge aus, die die Sequenz um den SNP herum sowie Kontrollbasen bereitstellt. Wählen Sie abschließend Histogramme aus, um eine grafische Darstellung dessen zu erhalten, wie Ihr Pyrogramm aussehen sollte. Nun ist es an der Zeit, einen SNP-Lauf einzugeben.

Unter „Snip läuft“ und dem allgemeinen Tab geben Sie einen Laufnamen ein und wählen die Instrumentenparameter für den Lauf aus. Wählen Sie im Setup-Tab den Assayeintrag aus und klicken und ziehen Sie über die Platte. Um den gewünschten Assay in Ihre Platte einzutragen, ist es wichtig zu beachten, dass die gesamte Platte nicht verwendet werden muss; Sie können verschiedene Wells für die Analyse deaktivieren, und es können auch mehrere verschiedene Assays auf derselben Platte durchgeführt werden.

Klicken Sie auf den Ansicht-Tab und wählen Sie dann „Ausführen“. Auf dieser Seite sind die geeigneten Volumina an Nukleotiden, Enzym und Substrat aufgeführt, die für den Durchlauf benötigt werden. Reinigen Sie sowohl die Nukleotid- oder Kapillarspitzen als auch die Reagenzienpipettenspitzen vor der Verwendung.

Füllen Sie die Spitzen mit Wasser und üben Sie Druck auf die Oberseite der Spitze aus, um auf mögliche Verstopfungen zu prüfen. Wenn kein Wasser aus der Unterseite der Spitze austritt, leeren und füllen Sie mehrmals wiederholt, um das Wasser durchzudrücken. Alternativ können Sie die Spitzen beschallen, falls die Verstopfung bestehen bleibt.

Verwerfen und neue Pipettenspitzen verwenden. Das Enzym und das Substrat sollten vor der Anwendung mit Wasser resuspendiert werden. Wenn durch Schütteln Luftblasen entstehen, die zu Verstopfungen der Spitzen oder ungleichmäßiger Dosierung führen könnten, können ungenutzte resuspendierte Enzyme und Substrate bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Für die spätere Verwendung von Kapillar-Dosierspitzen in einem Mikrozentrifugenröhrchen eine 1:1-Verdünnung mit den Nukleotiden und TE-Puffer P acht herstellen. Vor der Verwendung gründlich mischen. Die Nukleotid- und Reagenzien-Spitzen gemäß den vom Software vorgeschlagenen Mengen mit den entsprechenden Volumina füllen.

Geben Sie die Flüssigkeit vorsichtig an den Seiten der Spitzen entlang ab, um zu verhindern, dass Luftblasen beim Pipettieren in diese gelangen und Verstopfungen verursachen. Achten Sie darauf, die Spitzen für die Nukleotidabgabe auf eventuelle Luftblasen zu überprüfen. Sollten Luftblasen vorhanden sein, klopfen Sie einfach leicht gegen die Seiten der Spitzen, bis die Luftblasen an die Oberfläche steigen, oder lösen Sie sie mit einer sauberen Pipettenspitze.

Führen Sie eine Testplatte durch, nachdem Sie die Kartusche befüllt haben. Legen Sie die Kartusche in das Pyrosequenzierungsgerät und die Testplatte in die 96-Loch-Plattenplattform. Wenn Sie eine Haftfolie über die Platte legen, können die Reagenz- und Nukleotidapplikation leicht beobachtet werden.

Wählen Sie den Instrument-Tab auf der linken Seite des Bildschirms und anschließend „Verwalten“ aus. Wählen Sie das Instrument aus dem Dropdown-Menü aus. Klicken Sie auf „Test“, woraufhin eine Warnung angezeigt wird.

Bitte überprüfen Sie, ob die Testplatte in das Gerät eingelegt wurde. Klicken Sie auf „Okay“. Entfernen Sie nach Abschluss die Testplatte, und prüfen Sie, ob sich in der Mitte der Platte Flüssigkeitstropfen über sechs der Vertiefungen befinden, die für vier Nukleotide, Enzym und Substrat stehen.

Befinden sich weniger als sechs kleine Punkte, ist eine Verstopfung aufgetreten, und die Spitzen sollten auf Blockaden überprüft und diese gegebenenfalls entfernt werden. Stellen Sie die Platte in die Pyrosequenzierungs-Plattform mit 96 Vertiefungen. Schließen Sie alle Hebel und klicken Sie auf „Run“ für die einzelne Platte.

Starten Sie den Durchlauf: Die Enzymsubstrate und Nukleotide werden in der vorbestimmten Reihenfolge zudosiert. Sobald der Durchlauf durch den Pyrosequenzierer analysiert wurde, ist es an der Zeit, die Ergebnisse zu überprüfen. Blaue Wells stellen ein bestandenes Genotyp- und Pyroergebnis dar.

Orange Wells erfordern einen manuellen Eingriff und können bearbeitet werden, indem man auf den betreffenden Well klickt und das vorhergesagte Histogramm öffnet. Ein Genotyp kann bestanden, nicht bestanden oder überprüft werden, ebenso kann der Genotyp selbst entsprechend geändert werden. Sobald ein Well bearbeitet wurde, erscheint ein dunkler Kreis auf der Plattenkarte.

Negative Kontrollen sollten als negativ gewertet werden. Es können unspezifische Signale in den negativen Vertiefungen auftreten; diese werden jedoch typischerweise durch Schleifenbildung des internen Primers verursacht. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man einen Polymorphismus in menschlicher genomischer DNA mittels Pyrosequenzierung analysiert.

Die DNA-Pyrosequenzierung ist gegenüber anderen Sequenzierverfahren nützlich, weil sie für eine breite Palette von Anwendungen geeignet ist. Außerdem ist sie robust genug, um DNA aus jeder Quelle zu verarbeiten, einschließlich DNA mit niedriger Konzentration und degradierter DNA. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, mit einem sauberen, gut gereinigten PCR-Produkt zu beginnen.

Verwenden Sie für jeden Assay eine negative Kontrolle und stellen Sie sicher, dass alle Ihre Reagenzien in Ordnung sind. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.