Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen
20. November 2021
Lipidmonoschichten werden seit Jahrzehnten als Grundlage für die Bildung von zweidimensionalen (2D) Proteinkristallen für Strukturstudien verwendet. Sie sind an der Luft-Wasser-Grenzfläche stabil und können als dünnes Trägermaterial für die Elektronenbildgebung dienen. Hier stellen wir die bewährten Schritte zur Herstellung von Lipidmonolayern für biologische Studien vor.
Im Laufe der Jahre wurden Lipidmonoschichten als Stützschicht verwendet, um die 2D-Kristallisation von peripheren Membranproteinen sowie löslichen Proteinen zu fördern. Diese Methode kann auch auf die 2D-Kristallisation angewendet werden, wie einige integrale Membranproteine. Erfordert jedoch umfangreichere empirische Untersuchungen zur Bestimmung der Waschmittel- und Dialysebedingungen, um die Partitionierung in die Lipidmonoschicht zu fördern.
An der Luft-Wasser-Grenzfläche bildet sich eine Lipid-Monoschicht, so dass die polaren Kopfgruppen des Lipids in der wässrigen Phase hydratisiert bleiben. Und die unpolaren Acylschwänze der Lipidverteilung zur Luft-Wasser-Grenzfläche, die die Oberflächenspannung bricht und die Wasseroberfläche abflacht. Die Ladungsnatur die charakteristischen chemischen Anteile der Lipidkopfgruppen liefern die Affinität für Proteine in Lösung.
Förderung der Bindung und im Prinzip der 2D-Array-Bildung. Alle 2D-Kristalle, die auf einer Lipidmonoschicht gebildet werden, können leicht in das Elektronenmikroskop auf einem kohlenstoffbeschichteten EM-Gitter übertragen werden, das zum Anheben und Unterstützen des kristallinen Arrays auf der Lipidschicht verwendet wird. Wir haben in diesem Manuskript eine Lipid-Monolayer-Methodik für die kryogene Elektronenmikroskopie-Bildgebung beschrieben.
Lipid-Monolayer-Vorbereitung. Lipidstockzubereitung, herstellung einer Lipidmischung von 0,01 mg pro ml in 9:1 Volumen zu Volumen Chloroform, Methanol. Unter Verwendung von 8,91 ml Chloroform und 0,99 ml Methanol und 0,1 ml einer Lipidlösung von 10 mg pro ml.
Zubereitung von Teflonplatten. Beschallen Sie eine Teflonplatte in einem Methanolbad für fünf Minuten. Mit heißem Wasser für 15 Minuten waschen und dann mit destilliertem Wasser abspülen.
Trocknen Sie die Teflonplatte in einer getrockneten 30 Minuten und bewahren Sie sie bis zum Gebrauch unter Vakuum auf. Bildung von Lipid-Monoschicht auf Pufferreservoir. Die geschätzte Betriebszeit beträgt eineinhalb Stunden.
Legen Sie ein Filterpapier vom Typ eins in eine Petrischale und ordnen Sie den Teflonblock auf dem Filterpapier an. Füllen Sie die Vertiefungen der Teflonplatte mit 60 Mikrolitern Puffer. Fügen Sie vorsichtig flüssigkeitsmischung auf die Pufferoberfläche Tropfen für Tropfen hinzu.
Idealerweise ein Mikroliter pro Tropfen mit einer Hamilton-Spritze. Befeuchten Sie das Filterpapier mit destilliertem Wasser und halten Sie die Feuchtigkeit in der Petrischale. Bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubieren, das Chloroform sollte verdampfen und eine Monoschicht aus Lipid auf der Oberfläche der Puffer gebildet werden.
Auftragen eines EM-Gitters auf eine Lipid-Monoschicht. Geschätzte Betriebszeit eineinhalb Stunden. Platzieren Sie vorsichtig ein kohlenstoffbeschichtetes EM-Gitter ohne Glühen, das Kohlenstoff von der Seite nach unten auf die Oberfläche jedes Pufferbehälters ableitet.
Injizieren Sie vorsichtig Proteine in den seitlichen Injektionsbrunnen, verwenden Sie die endgültigen Proteinkonzentrationen in der Vertiefung um ein Mikromolar. 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Injizieren Sie vorsichtig etwa 20 bis 30 Mikroliter Puffer in den Injektionsanschluss der Stelle, um das Gitter über die Oberfläche des Teflonblocks anzuheben.
Auf diese Weise können Sie das Gitter mit einer Pinzette aufnehmen und vertikal vom Tropfen abheben. Repräsentative Ergebnisse. Eine auf einem EM-Gitter abgeschiedene Lipidmonoschicht kann unter dem Transmissionselektronenmikroskop ohne Kontrastfärbung sichtbar gemacht werden.
Das Vorhandensein von Monoschichten kann an der Kontrastdifferenz zu dem Bereich ohne Probe in diesem Strahlengang erkannt werden. Bereiche mit Lipid-Monolayer-Abdeckung haben einen geringeren Kontrast als Bereiche ohne Abdeckung. Da der Elektronenstrahl durch die leeren Löcher keine Streuung aufweist, zeigt er eine hellere Beleuchtung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Lipid-Monolayer-Methode aufgrund ihrer Einfachheit die Möglichkeit bietet, Proteinstrukturen zu untersuchen. Es kann einen alternativen Ansatz bieten, um den Prozess der 2D-Kristallisation zu erleichtern.
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Übersicht
Lipidmonolagen dienen als stabile Grundlage für die zweidimensionale Kristallisation von Proteinen und ermöglichen strukturelle Untersuchungen. Diese Methode ist besonders nützlich für periphere Membranproteine und lösliche Proteine und kann bei sorgfältiger Optimierung auch für integrale Membranproteine angepasst werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biophysik
- Strukturbiologie
- Biochemie
Hintergrund
- Lipid-Monolagen bilden sich an der Luft-Wasser-Grenzfläche.
- Die polaren Kopfgruppen verbleiben in der wässrigen Phase hydratisiert.
- Die unpolaren Acylketten lagern sich an der Luft-Wasser-Grenzfläche an.
- Die chemische Beschaffenheit der Lipid-Kopfgruppen beeinflusst die Proteinaffinität.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Herstellung von Lipid-Einfachschichten vorstellen.
- Die Kristallisation verschiedener Proteine unterstützen.
- Strukturuntersuchungen durch verbesserte Abbildungstechniken erweitern.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Lipid-Monolagen an der Luft-Wasser-Grenzfläche.
- Optimierung der Bedingungen für Detergenzien und Dialyse.
- Empirische Untersuchung der Proteinverteilung.
- Elektronenmikroskopische Abbildungstechniken für die strukturelle Analyse.
Hauptergebnisse
- Lipidmonolagen unterstützen die Protein-Kristallisation wirksam.
- Bestimmte Bedingungen erhöhen die Affinität von Proteinen zur Monolage.
- Integrale Membranproteine können bei weiterer Optimierung kristallisiert werden.
- Die Methode bietet eine stabile Plattform für die Elektronenmikroskopie.
Schlussfolgerungen
- Lipidmonolagen sind ein vielseitiges Werkzeug für die Strukturbiologie.
- Sie ermöglichen die Untersuchung sowohl peripherer als auch integraler Membranproteine.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um die Bedingungen für optimale Ergebnisse zu verfeinern.
Häufig gestellte Fragen
Exekutive Branchenrelevanz
Mittels Lipid-Einzelmembran-Methoden wird eine kontrollierte zweidimensionale Kristallisation von Proteinen ermöglicht, die die Strukturbestimmung von membranständigen und löslichen Zielstrukturen unterstützt. Dieser Ansatz verbessert die Target-Validierung, indem er reproduzierbare Plattformen für die biophysikalische Charakterisierung bereitstellt und somit Unsicherheiten in der frühen Phase der Wirkstoffentwicklung verringert. Die Methode trägt durch hochauflösende strukturelle Erkenntnisse zur mechanistischen Entschärfung von Risiken bei und unterstützt so die Optimierung von Wirkstoffkandidaten sowie Portfolio-Entscheidungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen und konformationellen Zuständen, die für die Zielstrukturenfunktion relevant sind.
- Operativer Wert: Bietet ein standardisiertes System zur Beurteilung der Stabilität und Bindungsfähigkeit des Zielmoleküls.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung des Zielmoleküls, indem strukturelle Analysen unter nahezu nativen Bedingungen ermöglicht werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt homogene, geordnete Protein-Arrays, die für hochauflösende Screening-Anwendungen geeignet sind.
- Operationaler Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung sicher, was für die Konsistenz von Assays über verschiedene Teams hinweg entscheidend ist.
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare strukturelle Ergebnisse, die eine Korrelation mit funktionellen Assay-Daten ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet strukturelle Einblicke in Membranproteine als Zielstrukturen und unterstützt das Verständnis von Krankheitsmechanismen.
- Operativer Wert: Erzeugt übertragbare Proben, die mit nachgeschalteten Kryo-EM-Arbeitsabläufen kompatibel sind.
- Wissenschaftlicher Wert: Stärkt die Vorhersagegenauigkeit, indem strukturelle Merkmale mit pharmakologischer Aktivität verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Lipid-Einfachschicht-Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows und unterstützt die Target-Validierung sowie die Leitstruktur-Identifizierung durch strukturelle Charakterisierung.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung durch strukturelle Visualisierung von Proteinanordnungen und -wechselwirkungen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays, indem gleichmäßige 2D-Kristalle für konsistente biophysikalische Messungen erzeugt werden.
- Analytik: Liefert hochauflösende Bildgebungsdaten, die Teams ermöglichen, strukturelle Zustände unter wechselnden Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet strukturelle Erkenntnisse mit der präklinischen Kontinuität, indem Zielmechanismen aufgeklärt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für strukturelles Screening über mehrere Proteinziele hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung durch direkte strukturelle Beobachtung.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung bei der Probenvorbereitung für strukturelle Studien.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch Verringerung struktureller Unsicherheiten bei der Zielauswahl.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung basierend auf validierten strukturellen und funktionellen Daten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Lipiden, der Proteinaufreinigung und der Grenzflächenwissenschaft.
- Hängt von dem Zugang zu reinraumtauglicher Ausrüstung wie Hamilton-Spritzen und Teflon-Substraten ab.
- Erfordert die Standardisierung von Pufferbedingungen und Inkubationszeiten über verschiedene Labore hinweg.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene Proteinklassen, insbesondere integrale Membranproteine.
- Ist durch die Notwendigkeit empirischer Optimierung von Detergens- und Dialysebedingungen für bestimmte Zielstrukturen begrenzt.
