Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und größenspezifische Lösungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel durch Optimierung der Sortierparameter der Durchflusszytometrie. Diese Optimierungen bieten eine Reihe kritischer Sortiereinstellungen, die es ermöglichen, repräsentative Populationen kleiner extrazellulärer Vesikel nur mit Vorwärtsstreuung im Vergleich zur Größenstreuung zu erhalten. Beginnen Sie mit dem Standard-Startvorgang des Durchflusszellensortierers.

Schalten Sie das Gerät ein, indem Sie die Starttaste drücken, und klicken Sie dann auf die Laser-Power-Taste auf dem Laser-Bedienfeld. Drücken Sie die Taste zum Wechseln der Tanks im Untermenü Smart Sampler, um die Fluidik unter Druck zu setzen. Verwenden Sie einen ultraschallgereinigten 50-Mikrometer-Strahl und eine Luftdüse und installieren Sie sie bis zur Düsenanordnung.

Stellen Sie den Druck auf 80 SI für die Mantelflüssigkeit und 80,3 SI für den Probenfluss an der Druckkonsole ein. Drücken Sie die Taste zum Starten des Mantelflusses, um den Mantelstrom zu starten. Klicken Sie im Untermenü Smart Sampler auf die Blasenschaltfläche, um die Blase automatisch für 10 Minuten zu entblasen und dann auszuschalten.

Um den Strahl auszurichten und den Laserspot zu bestimmen, schalten Sie das Licht der Beleuchtungskammer ein, um den Strahl über die Nadellöcher zu sehen. Stellen Sie die Mikrometer nach oben und unten, links und rechts sowie vorne und hinten ein, um den Stream auf der Lochblende zu zentrieren und den Stream zu fokussieren. Öffnen Sie alle Laserverschlüsse, wählen Sie die Registerkarte Laser- und Stream-Intercept aus und drücken Sie dann kontinuierlich die grüne Pfeiltaste, um den Kalibrierungsprozess für den Laserabfang und die Düsenausrichtung abzuschließen.

Greifen Sie auf den Bildschirm für die Feinlaserausrichtung zu. Wählen Sie den 640-Nanometer-Laser und den 772-bar-44-Bandpasskanal als Parameter für die x-Achse und den 405-Nanometer-Laser und den 448-bar-59-Bandpasskanal als Parameter für die y-Achse. Drücken Sie den Triggerparameter-Selektor und wählen Sie den Vorwärtsstreuparameter des 488-Nanometer-Lasers.

Als nächstes verdünnen Sie die regenbogenfluoreszierenden Partikel, indem Sie einen Tropfen in einen Milliliter doppelt destilliertes Wasser bis zu einer Endkonzentration von eins mal 10 bis zu den sechsten Kügelchen pro Milliliter geben. Öffnen Sie die Tür der Probenkammer und laden Sie ein Röhrchen mit vorbereiteten fluoreszierenden Regenbogenpartikeln. Drücken Sie die Starttaste und passen Sie die Mikrometer nach oben und unten an, um die Fluoreszenzintensität zu optimieren und jedes Signal so intensiv wie möglich zu machen.

Drücken Sie die Taste "Qualitätskontrolle starten" oder "QC" auf dem Touchscreen-Bedienfeld, um die Qualitätskontrolle automatisch durchzuführen. Drücken Sie dann die IntelliSort-Initialisierungstaste. Das Gerät passt automatisch die Frequenz und Amplitude der Tröpfchenschwingung an, um die Fallverzögerung von ca. 25 zu erhalten und den Abbruchpunkt des Tropfens klar zu visualisieren.

Drücken Sie als Nächstes die Drop-Delay-Taste und die Maintain-Taste. Wählen Sie Tube als Sortierausgabetyp aus. Legen Sie einen 15-Milliliter-Röhrchenhalter in die Sortierkammer.

Schalten Sie die Plattenspannung ein und stellen Sie die Plattenspannung auf ca. 4.000 Volt ein. Schalten Sie als Nächstes das Testmuster ein, indem Sie auf die Schaltfläche Stream-Setup klicken. Stellen Sie den Schieberegler für die Ladephase und den Schieberegler für die Ablenkung ein, um sicherzustellen, dass das Bild des Stroms mit dem Sammelrohr übereinstimmt.

Wählen Sie dann die Schaltfläche mit dem Häkchen aus. Melden Sie sich bei der Summit-Workstation auf dem Computer an. Erstellen Sie ein neues Protokoll aus dem Hauptmenü der Datei.

Erstellen Sie dann ein Punktdiagramm, indem Sie die Registerkarte Histogramm in der Systemsteuerung der Summit-Software auswählen. Wählen Sie Vorwärtsstreuung als Parameter für die x-Achse und Seitenstreuung als Parameter für die y-Achse. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die Achse des neuen Punktdiagramms im Arbeitsbereich und stellen Sie die Vorwärtsstreuung und die Seitenstreuung in logarithmischer Form dar.

Wählen Sie die Registerkarte "Erfassung" und suchen Sie den Bereich "Erfassungsparameter". Aktivieren Sie alle Signale im Untermenü der Parameter aktivieren. Wählen Sie Vorwärtsstreuung als Auslöseparameter und legen Sie den Schwellenwert auf 0,01 fest.

Stellen Sie die Spannung und Verstärkung der Vorwärtsstreuung und der Seitenstreuung auf 250 und 0,6 ein, um sicherzustellen, dass Ereignisse innerhalb des Vorwärtsstreudiagramms und der Seitenstreuung getrennt sind. Verdünnen Sie die fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokugeln in 100-, 200- und 300-Nanometer-Suspensionen, indem Sie einen Mikroliter Mikrokugeln zu einem Milliliter doppelt destilliertem Wasser hinzufügen. Laden Sie dann die Mikrokugelaufhängung nacheinander.

Wählen Sie im Erfassungsmenü von Summit Software die Option Start aus, um 20.000 Ereignisse aufzuzeichnen, und klicken Sie dann nach der Aufzeichnung der Ereignisse auf Stopp. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm des Vorwärtsstreu- und Seitenstreupunkts, um Rechtecke zu erstellen, und ziehen Sie, um die Größe zu ändern. Positionieren Sie die Bereiche des elektronischen Rauschens und der 100-Nanometer-Mikrosphärenpopulation neu, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Regionen klicken, um sie in R7 bzw. R4 umzubenennen.

Wiederholen Sie die Schritte, um die 200- und 300-Nanometer-Mikrokugeln nacheinander mit Rechtecken einzurahmen, und benennen Sie sie in R5 bzw. R6 um. Bestimmen Sie schließlich den Sortierbereich von 50 bis 200 Nanometern basierend auf dem elektronischen Rauschen und der Position von 200-Nanometer-Partikeln, um ihn als R8 zu definieren. Bearbeiten Sie Sortierentscheidungen im Bereich Sortierlogik und Statistik, indem Sie auf das leere Feld des linken oder L1-Streams doppelklicken und den Bereich mit dem Namen R8 auswählen, um die Sortierlogik zu erstellen. Wählen Sie den Abbruchmodus der Reinheit und wählen Sie eine Tröpfchenhülle über einem Tropfen für den L1-Stream.

Laden Sie eine 500-Mikroliter-Probe einer zuvor hergestellten extrazellulären Vesikel oder EVs-Mischung. Drücken Sie die Schaltfläche Start unter dem Erfassungsmenü in Summit, um die Daten zu erfassen, und klicken Sie dann auf Stopp. Drücken Sie anschließend im Sortiermenü auf Start, um 50 bis 200 Nanometer große kleine extrazelluläre Vesikel oder sEV in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu sammeln.

Die durchflusszytometrische Analyse von Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße, um den Größenbereich von 50 bis 200 Nanometern im Vorwärtsstreu- und Seitenstreudiagramm zu lokalisieren, ergab unterscheidbare Partikelsignale. R4, R5 und R6 beziehen sich auf die Positionen von 100-, 200- bzw. 300-Nanometer-Partikeln. R7 ist das elektronische Rauschen als Nachweisgrenze für 50-Nanometer-Partikel und R8 steht für den Positionsbereich von 50 bis 200 Nanometer-Partikeln.

Die Partikelgrößenverteilung der EVs-Mischung, die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) aus Pankreas-One-Zellen gewonnen wurde, lag nach der Ultrazentrifugation im weiten Bereich von 40 bis 400 Nanometern. Eine durchflusszytometrische Sortierung wurde durchgeführt, um die 50 bis 200 Nanometer sEV innerhalb der R8-Region zu isolieren und zu reinigen. Die Qualität der Isolierung wurde von NTA verifiziert und es wurde festgestellt, dass der Partikelgrößenbereich von sEV nach der Sortierung zwischen 50 und 200 Nanometern lag.

Das Vorhandensein von sEV wurde weiter durch TEM beobachtet und die isolierten sEVs wurden durch Western-Blot-Analyse bestätigt, dass sie Marker von CD6, CD63 und CD81 enthielten. Diese Methode ermöglicht die Trennung kleiner extrazellulärer Vesikel und die Klassifizierung oder Analyse der Genexpression kleiner extrazellulärer Vesikel, was zahlreiche nachgeschaltete Forschungsanwendungen eröffnet.