Multiplex-Immunfluoreszenz kombiniert mit räumlicher Bildanalyse zur klinischen und biologischen Beurteilung der Tumormikroumgebung
2. Juni 2023
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur manuellen Tyramid-Signalverstärkung (TSA) Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) in Kombination mit Bildanalyse und räumlicher Analyse beschrieben. Dieses Protokoll kann mit formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Schnitten für die Färbung von zwei bis sechs Antigenen pro Objektträger verwendet werden, je nachdem, welcher Objektträgerscanner im Labor verfügbar ist.
In unserem Labor untersuchen wir menschlichen Darmkrebs. Das Fortschreiten der metastasierenden Erkrankung und das Ansprechen auf die Behandlung, einschließlich der Immuntherapie. Wir versuchen, neue prädiktive und prognostische Biomarker zu finden, indem wir die Mikroumgebung des Tumorimmuns und das intratumorale Mikrobiom bei primären und metastasierten Erkrankungen untersuchen.
In unserem Projekt implementieren wir derzeit verschiedene Technologien wie RNA-Sequenzierung, Sequenzierung des gesamten Exoms, TCR-Sequenzierung, zirkulierende zellfreie DNA-Analyse, Immunfluoreszenz und Fluoreszenz-Institutshybridisierung. Im Moment besteht unsere größte Herausforderung darin, die Hybridisierungsfärbung des Fluoreszenzinstituts mit der Tyramid-Signalverstärkungs-Multiplex-Immunfluoreszenz zu kombinieren, um die Interaktion zwischen dem Mikrobiom und den Immunzellen zu untersuchen. Unsere Methode ist robust, reproduzierbar, einfach anzuwenden und kostengünstig.
Es kann in jedem Labor eingerichtet werden, das über einen Fluoreszenzlichtscanner verfügt, und die Methode kann mit jedem kommerziell erhältlichen IHC-Antikörper verwendet werden, im Gegensatz zu kommerziell erhältlichen Kits, die normalerweise für eingeschränkte Antigene optimiert sind.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll für die manuelle Tyramid-Signalverstärkung (TSA) in Kombination mit multiplexer Immunfluoreszenz (mIF) sowie Bild- und räumlicher Analyse beschrieben. Die Methode ist auf formalinfixierte, paraffin-eingebettete (FFPE) Schnitte anwendbar und ermöglicht die Färbung mehrerer Antigene pro Objektträger.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Pathologie
Hintergrund
- Untersuchung des menschlichen kolorektalen Karzinoms und dessen Progression.
- Schwerpunkt auf dem tumorimmunologischen Mikromilieu und dem intratumoralen Mikrobiom.
- Verwendung verschiedener Technologien, einschließlich RNA-Sequenzierung und Immunfluoreszenz.
- Herausforderungen bei der Kombination unterschiedlicher Färbemethoden für eine umfassende Analyse.
Zweck der Studie
- Neue prädiktive und prognostische Biomarker zu finden.
- Die Interaktion zwischen Mikrobiom und Immunzellen zu untersuchen.
- Eine robuste und reproduzierbare Färbemethode zu entwickeln.
Verwendete Methoden
- Manuelle Tyramid-Signalverstärkung-Multiplex-Immunfluoreszenz.
- Bildanalyse mittels hochmultiplexer Fluoreszenz-Algorithmen.
- Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung kombiniert mit Immunfluoreszenz.
- Detaillierte Färbeprotokoll für FFPE-Gewebeschnitte.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Färbung mehrerer Antigene auf einem einzelnen Objektträger.
- Optimierung der Antikörperspezifität und des Signal-Rausch-Verhältnisses.
- Effektive Bildanalyse zur Gewinnung quantifizierbarer Daten.
- Nachweis der Anwendbarkeit der Methode in verschiedenen Laboren.
Schlussfolgerungen
- Die TSA-mIF-Methode ist vielseitig und kosteneffektiv.
- Sie kann an verschiedene Antikörper und Antigene angepasst werden.
- Dieser Ansatz verbessert das Verständnis der Tumorbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) mit räumlicher Bildanalyse ermöglicht eine inhaltsreiche, quantitative Abbildung des Tumormikromilieus (TME) und unterstützt die Entdeckung von Biomarkern sowie die mechanistische Risikominimierung in onkologischen Entwicklungsprozessen. Dieser Arbeitsablauf liefert handfeste Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen Immun- und Stromazellen und trägt so zu prädiktiven Biomarker-Strategien und der translationellen Forschung bei. Aufgrund seiner Reproduzierbarkeit und Kompatibilität mit einer Vielzahl von Antikörpern stellt er eine skalierbare Methode für die onkologische Forschung und Entwicklung auf Unternehmensebene dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die räumlich aufgelöste Untersuchung von Interaktionen zwischen Immun- und Tumorzellen zur Zielvalidierung.
- Unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung durch Quantifizierung der Zelltyp-Dichten und -Nähen innerhalb von Tumorkompartimenten.
- Erleichtert die Identifizierung neuartiger prädiktiver und prognostischer Biomarker für die Portfolio-Priorisierung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Gewebesysteme für die nachgeschaltete multiplexe Biomarker-Screening-Analyse vor.
- Liefert standardisierte, reproduzierbare und quantitative räumliche Daten für die Assay-Entwicklung.
- Ermöglicht eine robuste Bewertung der Antikörperspezifität und die Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses für die Screening-Bereitschaft.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die räumliche Biomarker-Analyse in Verbindung mit krankheitsrelevanten Modellen für eine translationale Kontinuität.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung durch die Verknüpfung von TME-Eigenschaften mit Hypothesen zur therapeutischen Wirksamkeit.
- Liefert quantitative Ergebnisse für vergleichende Analysen über verschiedene Studien und Kohorten hinweg in der präklinischen Forschung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser mIF- und räumliche Analyse-Workflow verbindet die frühe Entdeckung, die Validierung von Biomarkern und die translationale Forschung in Onkologie-Portfolios.
- Entdeckungsbiologie: Quantifiziert die Verteilung von Immun- und Stomazellen, um TME-getriebene Mechanismen aufzuklären.
- Screening: Standardisiert multiplexe Gewebetests für reproduzierbare, quantitative Auswertungen.
- Analytik: Exportiert räumliche und Dichtedaten zur statistischen Vergleichbarkeit von Tumorkompartimenten und Zellinteraktionen.
- Translationale Forschung: Verknüpft räumliche Biomustermuster mit der therapeutischen Wirkung und unterstützt die Kontinuität von präklinischen zu klinischen Studien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Anpassbar an jedes Antikörpanel und jeden Tumortyp, was eine breite Anwendung im Portfolio ermöglicht.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Auswahl von Biomarkern und Zielstrukturen, indem räumliche Zellwechselwirkungen aufgeklärt werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht reproduzierbare, skalierbare und kosteneffiziente multiplexierte Gewebeanalysen.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und verringert biologische Risiken in späteren Entwicklungsphasen durch eine robuste Charakterisierung der Tumorumgebung (TME).
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung onkologischer Assets basierend auf räumlichen Biomarker-Befunden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Immunfluoreszenz, Bildanalyse und statistischer Datenauswertung.
- Benötigt Zugang zu einem fluoreszenzbasierten Objektträger-Scanner und kompatibler Bildanalyse-Software.
- Setzt eine standardisierte, interdisziplinäre Validierung von Antikörpern und Färbeprotokollen voraus.
- Anpassbar an verschiedene Tumortypen und Antikörper-Panels bei entsprechender Optimierung.
- Hängt von der strengen Spezifität der Antikörper und der Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses für verlässliche Ergebnisse ab.
