Probenvorbereitung für die In-situ-Kryotomographie von Säugetierzellen
15. Dezember 2023
Diese Methode bietet ein zugängliches und flexibles Protokoll für die Herstellung von Elektronenmikroskopie-Gittern (EM) für die zelluläre In-situ-Kryotomographie und die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM).
Ziel dieser Forschung ist es, eine Methodik für die Probenvorbereitung zu entwickeln, die sowohl zugänglich als auch zuverlässig reproduzierbar ist. Auf diese Weise kann die Leistungsfähigkeit der direkten zellulären Kryo-Elektronentomographie genutzt werden, um eine Vielzahl biologischer Fragestellungen zu beantworten. Die Herausforderungen bei der Netzvorbereitung sind groß.
Zellen heften sich nicht ohne weiteres an Gitter, und die Manipulation kann zu einer Beschädigung der Kohlenstoffschicht führen, was zum Verlust von abbildbaren Gitterbereichen führt. Darüber hinaus wird die Prävalenz dünner zellulärer Ausstülpungen reduziert, ohne dass auf die richtigen Bedingungen für die Probenvorbereitung geachtet wird. Derzeitige Protokolle erfordern in der Regel spezielle Geräte, um die größten Engpässe beim Seeding zu lösen, wie z. B. Mikrostrukturierung und 3D-gedruckte Halterungen für die Zellanhaftung bzw. -manipulation.
Dieses Protokoll bietet Lösungen mit besserer Zugänglichkeit, während gleichzeitig die Flexibilität für die Verwendung dieser spezialisierten Tools für nachgelagerte Anwendungen erhalten bleibt.
Übersicht
Diese Methode bietet ein zugängliches und flexibles Protokoll zur Herstellung von Elektronenmikroskopie-(EM-)Gittern für die in-situ-zelluläre Kryotomographie und die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM). Das Protokoll befasst sich mit Herausforderungen bei der Gitterpräparation, stellt die Zellanheftung sicher und minimiert Schäden an der Kohleschicht.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Elektronenmikroskopie
Hintergrund
- Direkte zelluläre Kryoelektronentomographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die biologische Forschung.
- Die Gitterpräparation ist entscheidend für eine erfolgreiche Abbildung und Analyse.
- Aktuelle Methoden erfordern häufig spezialisierte Geräte, was die Zugänglichkeit einschränkt.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, den Prozess zu vereinfachen, gleichzeitig aber Flexibilität zu bewahren.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer reproduzierbaren und zugänglichen Methodik zur Herstellung von EM-Gittern.
- Verbesserung der Anwendbarkeit der Kryo-Elektronentomographie in biologischen Untersuchungen.
- Lösung häufig auftretender Probleme bei der Zelladhäsion und Gitterintegrität.
Verwendete Methoden
- Plasmabehandlung von Objektträgern zur Verbesserung der Zelladhäsion.
- Aufbringen von bovinem Fibronectin zur Förderung der Zellanlagerung.
- Ansäen von Zellen und Transfektionsverfahren für HIV-Molekularklone.
- Schreckgefrieren von Objektträgern für die Kryo-Elektronentomographie-Bildgebung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Anheftung von Zellen an EM-Gittern mit minimalen Schäden.
- Beobachtung von HIV-produzierenden Zellen mittels kryokorrelativer Mikroskopie.
- Effektive Erhaltung der Gitterintegrität während des Herstellungsprozesses.
- Nachweis der Reproduzierbarkeit des Protokolls über mehrere Versuche hinweg.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll verbessert den Zugang zur EM-Gitterpräparation.
- Es ermöglicht die effektive Untersuchung zellulärer Prozesse mittels Kryo-Elektronentomographie.
- Zukünftige Anwendungen können diese Methode für verschiedene biologische Fragestellungen nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Eine robuste Probenvorbereitung für die in situ-Cryotomographie von Säugetierzellen ist entscheidend, um hochauflösende strukturelle Untersuchungen in nativen zellulären Kontexten zu ermöglichen. Dieses Protokoll behebt wesentliche Engpässe bei der Gitterhandhabung, Zelladhäsion und Reproduzierbarkeit, die sich direkt auf die Zuverlässigkeit der nachgeschalteten Bildgebung und integrativen Analysen auswirken. Eine verbesserte Zugänglichkeit und Standardisierung der Probenvorbereitung erhöht das Vorhersagevertrauen sowie die Qualität von Portfolio-Entscheidungen in der frühen Forschung und der translationsmedizinischen Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Visualisierung der zellulären Ultrastruktur zur mechanistischen Risikominimierung.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem native Zellumgebungen erhalten bleiben.
- Ermöglicht die hypothesengeleitete Untersuchung molekularer Assemblierungen in situ.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte biologische Proben für korrelative Bildgebungsworkflows vor.
- Standardisiert die Gitterpräparation, um Reproduzierbarkeit und quantitative Bildgebungsresultate sicherzustellen.
- Verbessert die Eignung für Hochdurchsatz-Screenings und integrative Mikroskopieplattformen.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt bildgebende Ergebnisse mit krankheitsrelevanten zellulären Modellen für eine translationale Kontinuität in Einklang.
- Ermöglicht die strukturelle Beurteilung von virus- und zellulären Wechselwirkungen in präklinischen Systemen.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem hochpräzise morphologische Daten bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll zur Probenvorbereitung verbindet die Schnittstelle zwischen Entdeckungsbiologie und fortgeschrittener Bildgebung und unterstützt Arbeitsabläufe von frühen mechanistischen Studien bis hin zur Validierung präklinischer Modelle.
- Entdeckungsbiochemie: Bietet reproduzierbare Probenvorbereitung zur Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen.
- Screening: Stellt standardisierte, hochwertige Gitter für quantitative Bildgebung und Assay-Entwicklung bereit.
- Analytik: Ermöglicht die Gewinnung robuster struktureller Daten für den Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet Grundlagen- und präklinische Forschung, indem der zelluläre Kontext in den bildgebenden Ergebnissen erhalten bleibt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen flexiblen und zugänglichen Protokollablauf, der an verschiedene Zelltypen und Bildgebungsmodalitäten angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert Mehrdeutigkeiten bei der strukturellen Target-Validierung.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit, Standardisierung und Skalierbarkeit von Probenvorbereitungsabläufen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem bildgebende Fehlschläge reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung strukturell validierter Targets.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, Gitterhandhabung und Mikroskopietechniken.
- Benötigt Zugang zu Geräten zur Plasmabehandlung, Sicherheitswerkbänken und Tauchgefrierausrüstung.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg für reproduzierbare Gitterpräparation und Bildqualität voraus.
- Kann an verschiedene adhärente, säugetierliche Zelltypen angepasst werden, wobei gegebenenfalls Modifikationen des Protokolls erforderlich sind.
- Die Empfindlichkeit und Handhabung der Gitter stellen nach wie vor praktische Einschränkungen dar, die sorgfältiges Vorgehen erfordern.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Preparing Electron Microscopy (EM) Grids for Cellular Cryotomography
3:34
Cell Seeding and Transfection on Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
5:34
Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
