Ein webbasierter Workflow zur Auswahl gen- und gewebespezifischer Enhancer

Wir sind daran interessiert, das nicht-kodierende Genom zu entschlüsseln, um zu verstehen, wie Gene reguliert werden, um zur richtigen Zeit und am richtigen Ort exprimiert zu werden. Wir entwickeln benutzerfreundliche Protokolle mit webbasierten Genomik-Tools, um allen Biologen einen besseren Zugang zu erweiterten Entdeckungen zu ermöglichen. Breite Verfügbarkeit von multimodalen Daten, die dazu beitragen können, den Standort von Enhancern einzugrenzen, und der einfache Zugriff auf diese Daten über Open-Source-Webschnittstellen.

Dies ermöglicht eine umfassende Identifizierung von Enhanceren, ohne dass Programmierkenntnisse von Forschern erforderlich sind. Dieses Protokoll bietet eine Grundlage für jeden, der keinen Hintergrund in der Enhancer-Biologie hat, um mit der Navigation durch öffentlich zugängliche Datensätze zu beginnen, um Enhancer für die interessierenden Gene abzurufen. Als Fallstudie verwenden wir TBX5, einen bekannten Akteur in der Herzbiologie.

Unser Workflow identifizierte 21 Enhancer, die Aufschluss über die Entwicklungsmechanismen des Herzens und angeborene Herzfehler geben könnten. Wir werden unser Protokoll um neue Datenquellen erweitern, einschließlich der räumlichen Genomik, und gleichzeitig zusätzliche benutzerfreundliche Werkzeuge für Biologen entwickeln. Öffnen Sie zunächst den Ensembl Genome Browser.

Wählen Sie die Genomassemblierung aus, die der gewünschten Spezies und Version entspricht. Geben Sie das gewünschte Gen in das Suchfeld ein und klicken Sie auf Los.Klicken Sie in den Ergebnissen auf die entsprechende Ensembl-Gen-ID.Scrollen Sie dann zum Abschnitt "Zusammenfassung" und klicken Sie auf den Link "Region im Detail", um die umgebende Region des interessierenden Gens zu visualisieren. Suchen Sie nun mit der Genlegenden-Spur nach den beiden Genen, die das interessierende Gen flankieren.

Diese Gene erscheinen als visuelle Elemente, die verschmolzene Ensembl- und Havanna-Annotationen innerhalb der grundlegenden Genannotationen aus der GENCODE-Spur darstellen. Bestimmen Sie die Richtungsabhängigkeit des interessierenden Gens, indem Sie die Größer-als- oder Kleiner-als-Zeichen neben den Gennamen beobachten. Klicken Sie auf die intergene Region zwischen diesen Genen, ziehen Sie den Cursor und klicken Sie dann im Popup-Fenster auf "Zur Region springen", um die ausgewählte Region anzuzeigen.

Passen Sie die Anzeige an, indem Sie oben in der Spuranzeige auf "Hinzufügen" oder "Spuren entfernen" klicken. Verwenden Sie die Zoom- und Navigationssteuerelemente, um die Ansicht für eine verbesserte Visualisierung des Bereichs anzupassen. Klicken Sie in der Seitenleiste auf der Registerkarte "Region im Detail" auf "Diese Seite konfigurieren".

Wählen Sie in der Randleiste "Regionsbild konfigurieren" unter "Regulierung" die Option Aktivität nach Zelle oder Gewebe aus. Verwenden Sie die Zell- oder Gewebesuchleiste, um das gewünschte Gewebe zu finden und auszuwählen, oder verwenden Sie den alphabetischen Index unter der Leiste. Klicken Sie auf die Registerkarte Experimente"neben der Option Zelle oder Gewebe".

Wählen Sie H3K4me1 und H3K27ac als Marker für Enhancer und H3K4me3 als Marker für Promoter und klicken Sie auf "Track Display konfigurieren". Wählen Sie dann "Tracks anzeigen", um durch H3K4me1 markierte Regionen innerhalb der Enhancer-Nachweisregion und durch H3K4me3 markierte Regionen stromaufwärts des interessierenden Gens zu visualisieren. Klicken Sie auf die farbigen visuellen oder Box-Elemente in der H3K4me1-Spur, um die genomischen Koordinaten der Regionen abzurufen, die innerhalb der definierten Nachweisregion markiert sind.

Dadurch wird das Popup-Fenster Hists und Pols geöffnet, in dem die genomische Position des Elements in Basenpaaren angezeigt wird. Alternativ können Sie die interessierenden Regionen für jedes genomische Merkmal manuell definieren, indem Sie auf die Spur klicken und ziehen, um die Peaks des Diagramms unter den Spuren H3K4me1 oder H3K27ac einzuschließen. Kopieren Sie dann die Koordinaten der genomischen Lokalisierung in eine Textdatei und speichern Sie die Datei im BED-Format.

Greifen Sie auf das 4DN Data Portal zu. Stellen Sie auf der Startseite sicher, dass "Experimentsets" als Y-Achse des gestapelten Hauptbalkens ausgewählt ist, "Experimenttyp" als X-Achse ausgewählt ist und das Diagramm nach Organismus gruppiert ist. Platzieren Sie den In-Situ-Hi-C-Balken entlang der X-Achse und klicken Sie auf den Teil, der menschliche Versuchssätze darstellt.

Klicken Sie im Popup auf die Schaltfläche "Durchsuchen" und wählen Sie Herzmuskelmyoblasten und unser interessierendes Gen TBX5 aus, das mit der Herzorganogenese in Verbindung gebracht wird. Klicken Sie auf den Link in der Spalte "Titel" der entsprechenden Bioprobe, die dem interessierenden Gewebe entspricht. Klicken Sie dann auf der Registerkarte "Verarbeitete Dateien" auf "Daten durchsuchen", um den Hi-C-Datensatz genauer zu untersuchen.

Geben Sie die Koordinaten des identifizierten Promotors im interessierenden Gewebe ein und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Heatmap, um den Bereich horizontal zu markieren. Diese Linien ermöglichen es, den Promotorbereich über die Heatmap hinweg visuell zu verfolgen. Passen Sie die Ansicht bei Bedarf an, indem Sie sie vertikal ziehen, bis die oberen und unteren Grenzen in den Y-Koordinaten der Suchleiste mit den Grenzen des Interessenbereichs übereinstimmen.

Um unerwünschte Linien zu entfernen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Linie, wählen Sie "Horizontal" oder "Vertikale Linie" und klicken Sie dann auf Reihe schließen. Geben Sie die Koordinaten aller experimentell validierten Control Enhancer ein, um den Interaktionsschwellenwert basierend auf ihren minimalen Interaktionswerten zu berechnen. Zeigen Sie die drei Kontrollverstärker aus der Literatur neben der Promotorregion aus Ensembl in der vorbereiteten Ansicht an.

Definieren Sie dann den Promotor-Enhancer-Schwellenwert mithilfe dieser Kontrollenhancer, indem Sie den niedrigsten Interaktionswert ungleich Null auswählen, der durch den Farbschlüssel auf der rechten Seite der Heatmap-Matrix angezeigt wird. Geben Sie die genomischen Koordinaten aller H3K4me1-assoziierten Enhancer-Regionen ein und markieren Sie sie vertikal auf der Hi-C-Heatmap. Filtern Sie schwach interagierende Regionen heraus, indem Sie die Interaktionswerte von H3K4me3-markierten Regionen mit dem Interaktionsschwellenwert vergleichen.

Wählen Sie die genomischen Koordinaten aus, die Interaktionshäufigkeiten oberhalb dieses Schwellenwerts anzeigen, die als konzentriertere oder dunklere Signale auf der Heatmap erscheinen, und speichern Sie sie im BED-Format. Drei der vier im VISTA Cardiac Enhancer Browser identifizierten Herzverstärker, HS2329, mm1282 und mm370, überlappten sich mit Regionen, die vom webbasierten Enhancer-Erkennungsprotokoll vorhergesagt wurden. Enhancer Two überlappte sich sowohl mit einer Region, die durch das Enhancer-Detektionsprotokoll vorhergesagt wurde, als auch mit einem experimentell validierten Enhancer.

Enhancer 16 zeigte eine Überlappung sowohl mit den vorhergesagten Enhancer-Regionen als auch mit früheren experimentellen Daten. Enhancer Nine überlappte sich nicht mit den vorhergesagten Enhancern aus der Pipeline, zeigte aber eine partielle H3K4me1-Signalanreicherung.